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多組學(xué)聯(lián)合分析，拿下CNS牛刊不是夢(mèng)
以下文章轉(zhuǎn)載于果殼生物，原作者Jay
微生物群（Microbiota）是指特定時(shí)間及特定生境中所有微生物有機(jī)體的總稱(chēng)，包括非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病毒、原核生物中的細(xì)菌和古菌及真核細(xì)胞微生物。微生物組（Microbiome）是指特定時(shí)間及特定生境中微生物群所包含的基因序列（含同源序列總和）。近年來(lái)，針對(duì)環(huán)境微生物的研究，逐漸成為各個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前基于環(huán)境微生物的測(cè)序策略主要包括微生物多樣性、宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組等多個(gè)產(chǎn)品。其中應(yīng)用最廣泛的是微生物多樣性，目前在人體腸道菌群、皮膚、口腔、陰道、土壤、水體、空氣及發(fā)酵等研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。
環(huán)境樣本中的微生物
近年來(lái)，基于微生物多樣性測(cè)序技術(shù)發(fā)表的文章呈現(xiàn)逐年攀升的趨勢(shì)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2019年，僅細(xì)菌多樣性發(fā)表文章數(shù)量約達(dá)2700篇，截止2020年7月已經(jīng)發(fā)表約1600篇。但是隨著測(cè)序技術(shù)的不斷完善和科研水平的日益提升，單一組學(xué)很難滿(mǎn)足科研需求，利用多組學(xué)聯(lián)合分析的手段解決科學(xué)問(wèn)題已然是大勢(shì)所趨。小編基于文獻(xiàn)調(diào)研和多年的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了關(guān)于微生物多樣性測(cè)序技術(shù)多組學(xué)文章的研究思路及其案例，希望對(duì)各位老師的科學(xué)研究有所幫助。
數(shù)據(jù)來(lái)源于NCBI，搜索關(guān)鍵詞“16S + diversity”
微生物多樣性
微生物多樣性測(cè)序技術(shù)是研究環(huán)境樣本中微生物的物種種類(lèi)和豐度。
基于單獨(dú)的微生物多樣性測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)表的文章思路比較簡(jiǎn)單，首先通過(guò)物種分布柱狀圖和α多樣性對(duì)環(huán)境樣本中物種的組成進(jìn)行初步的分析。然后通過(guò)β多樣性宏觀分析不同樣本/組間是否存在差異，如果存在差異，通過(guò)Metastats和LEfSe分析找出導(dǎo)致不同樣本/組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)建菌，找到了關(guān)建菌之后就可以結(jié)合研究背景進(jìn)行深入探討，也可以通過(guò)功能基因預(yù)測(cè)揭示在環(huán)境樣本中關(guān)鍵菌可能發(fā)揮著的功能和參與的代謝途徑等，從而來(lái)揭示科學(xué)問(wèn)題。此外，可以結(jié)合生理生化指標(biāo)進(jìn)行RDA/CCA分析，從而明確生理生化指標(biāo)和特定物種及樣本間的相關(guān)性。
微生物多樣性主要分析結(jié)果
微生物多樣性案例解析
Microbiome：農(nóng)業(yè)管理和植物選擇相互作用影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)和氮循環(huán)
Agricultural management and plant selection interactively affect rhizosphere microbial community structure and nitrogen cycling，2019，Microbiome，DOI:10.1186/s40168-019-0756-9.
根際微生物群落是由農(nóng)業(yè)管理和宿主選擇過(guò)程之間的相互作用形成的。本研究基于QIIME2分析流程探討農(nóng)業(yè)管理(M)和根際效應(yīng)(R)對(duì)長(zhǎng)期常規(guī)管理和有機(jī)管理的玉米-番茄輪作農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中玉米根部微生物群落結(jié)構(gòu)和共生網(wǎng)絡(luò)影響，揭示這些因素之間的相互作用及其影響根際微生物類(lèi)群、共生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和微生物氮循環(huán)的過(guò)程。本研究對(duì)土壤樣本進(jìn)行16S V4和ITS1多樣性測(cè)序，ASV分析結(jié)果顯示細(xì)菌和古菌多樣性受管理系統(tǒng)和土壤生態(tài)位的影響，真菌群落結(jié)構(gòu)組成僅受管理影響，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)僅受植物選擇影響。對(duì)氮循環(huán)功能基因進(jìn)行qPCR，定量結(jié)果表明只有nosZ基因豐度受管理的影響，且在有機(jī)系統(tǒng)中豐度更高。
文章主要分析結(jié)果
微生物多樣性+宏基因組學(xué)
微生物多樣性，快速且經(jīng)濟(jì)，由于PCR過(guò)程導(dǎo)致了偏好性，可能降低了注釋準(zhǔn)確度。原核、真核生物的“分類(lèi)標(biāo)簽”完全不同，即使細(xì)菌和古菌的16S也有很大差異，病毒更難捕獲，且只能初步預(yù)測(cè)功能結(jié)構(gòu)信息。宏基因組有效避免了擴(kuò)增偏差，環(huán)境樣本中Total DNA被直接打斷，物種注釋更全面（細(xì)菌、真菌、古菌及真核生物等），此外，還可能組裝獲得新基因乃至新物種信息，主要側(cè)重于群落的功能結(jié)構(gòu)研究。那么如何更高效、準(zhǔn)確的了解微生物物種組成、多樣性、功能組成及豐度情況呢？采用16S和宏基因組聯(lián)合分析已經(jīng)成為高分文章的主流思路。首先基于16S進(jìn)行大樣本測(cè)序分析，宏觀篩選出不同條件樣本間物種種類(lèi)和豐度差異比較大或者比較有代表性的樣本，進(jìn)行宏基因組測(cè)序，不僅可以驗(yàn)證16S的分析結(jié)論的準(zhǔn)確性，還可以更加深入挖掘功能基因和代謝通路等，以此闡明群落的功能情況，更好的說(shuō)明微生物群落與環(huán)境之間的關(guān)系。
微生物多樣性+宏基因組學(xué)研究思路
微生物多樣性+代謝組學(xué)
近年來(lái)，隨著微生物組學(xué)研究的不斷發(fā)展，很多界內(nèi)大佬紛紛開(kāi)始將微生物組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合起來(lái)，以期從物種、基因以及代謝產(chǎn)物等水平共同解釋科學(xué)問(wèn)題，廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)疾病腫瘤、中醫(yī)中藥、食品科學(xué)及畜牧水產(chǎn)等研究領(lǐng)域。微生物多樣性測(cè)序技術(shù)可以解決"who is there"（那有誰(shuí)），宏基因組測(cè)序技術(shù)可以解決 "what are they doing"（在干嘛）的問(wèn)題。而代謝組學(xué)是研究生物體中代謝產(chǎn)物變化的科學(xué)，常用研究方法包括了：LC/MS（液質(zhì)聯(lián)用），GC/MS（氣質(zhì)聯(lián)用）和NMR（核磁共振），可以解決"what have really happened"的問(wèn)題。目前基于微生物多樣性+代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)分析的研究思路，可參考下文案例。
微生物多樣性+代謝組學(xué)研究思路
微生物多樣性+代謝組學(xué)案例解析
Nature 子刊：人群隊(duì)列的腸道菌群和血液代謝物的關(guān)系
Relationship between gut microbiota and circulating metabolites in population-based cohorts，2019，Nature Communications，DOI: 10.1038/s41467-019-13721-1.
目前，很多研究報(bào)道揭示腸道菌群主要通過(guò)微生物的代謝和免疫信號(hào)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而影響著人類(lèi)的健康。研究表明肥胖、糖尿病、心血管疾病與腸道微生物密切關(guān)聯(lián)，微生物是循環(huán)血脂水平主要的驅(qū)動(dòng)者。本研究主要基于Rotterdam（n = 1390，平均年齡56.9±5.9，女性57.5％）和 LifeLines-DEEP（n = 915，平均年齡44 ± 13.9，女性的58.7％）兩隊(duì)列的志愿者，進(jìn)行糞便樣本16S V4細(xì)菌多樣性測(cè)序和血液樣本代謝物的檢測(cè)（NMR）。通過(guò)線性回歸分析評(píng)估腸道菌群與代謝物之間的關(guān)系，同時(shí)校正了年齡、性別、BMI、技術(shù)協(xié)變量、藥物使用及多項(xiàng)檢測(cè)。該研究結(jié)果找到了32個(gè)微生物科/屬與極低密度和高密度亞組分、血脂測(cè)定、糖酵解相關(guān)代謝物、酮體、氨基酸及急性反應(yīng)標(biāo)記物，為了解微生物群在宿主代謝中的作用提供理論依據(jù)。
校正了多種驗(yàn)證，年齡，性別，體重指數(shù)，技術(shù)協(xié)變量，用藥后等，循環(huán)代謝物與腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)分析
微生物多樣性+宏基因組學(xué)+代謝組學(xué)
人體與其共生的微生物組成了整個(gè)龐大而縝密的“個(gè)體”，與人體共生的微生物個(gè)數(shù)約100W億，而腸道菌群占據(jù)主要的人體微生物的組成，腸道微生物包括有益菌和有害菌，時(shí)刻影響著人體大腦的功能、情緒和行為。這些錯(cuò)綜復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的溝通交流途徑構(gòu)成了我們所熟知的“腸腦軸”（MGB）。2019年，發(fā)表在《Physiol Review》雜志上題目為《The microbiota-gut-brain axis》的文章研究結(jié)果表明，腸道微生物通過(guò)腸-腦軸調(diào)控腦功能和行為。無(wú)菌動(dòng)物、抗生素、糞菌移植、腦成像、測(cè)序和生物信息學(xué)等是主要研究手段。菌群-腸-腦軸在不同年齡階段呈現(xiàn)不同的微生物群落結(jié)構(gòu)，腸道菌群與腦通過(guò)自主神經(jīng)、腸神經(jīng)、免疫系統(tǒng)、腸內(nèi)分泌信號(hào)、神經(jīng)遞質(zhì)、支鏈氨基酸、膽汁酸、短鏈脂肪酸、脊髓、下丘腦-垂體-腎上腺軸、肽聚糖等途徑和介質(zhì)進(jìn)行雙向交流。環(huán)境、飲食、遺傳、壓力等因素影響菌群-腸-腦軸，菌群參與多種神經(jīng)相關(guān)疾病。近年來(lái)，疾病與菌群-腸-腦軸（MGB）方向的研究逐漸火熱，在頂尖雜志上的報(bào)道均取得突破性進(jìn)展。
文章主要分析結(jié)果
微生物多樣性+宏基因組學(xué)+代謝組學(xué)案例解析
Science 子刊：精神分裂癥患者潛在的菌群-腸-腦軸作用機(jī)制
The gut microbiome from patients with schizophrenia modulates the glutamate-glutamine-GABA cycle and schizophrenia-relevant behaviors in mice，2019，Science Advances，IF 11.511
腸道微生物可以通過(guò)菌群-腸-腦軸（MGB）調(diào)節(jié)腦功能和行為。研究表明，MGB的紊亂可能與 SCZ（精神分裂癥）的發(fā)生有關(guān)。為解析腸腦軸的發(fā)育是否與精神分裂癥有關(guān)，本研究首先基于健康人群（HCs）和精神分裂癥患者（SCZ）糞便樣本進(jìn)行16S V3+V4細(xì)菌多樣性測(cè)序。發(fā)現(xiàn)SCZ與HCs相比，有明顯失調(diào)的腸道微生物，由Aerococcaceae、Bifidobacteriaceae、Brucellaceae、Pasteurellaceae和Rikenellaceae 組成的特定的微生物團(tuán)體可以作為區(qū)分SCZ 和 HCs（AUC=0.769）的biomarker。其次，將SCZ和HCs的糞便移植到無(wú)菌小鼠體內(nèi)驗(yàn)證其腸道微生物功能，對(duì)移植兩周后的小鼠糞便進(jìn)行宏基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與Control FTM小鼠相比，SCZ的FTM小鼠富集脂質(zhì)和氨基酸代謝的基因會(huì)更多。同時(shí)，對(duì)小鼠糞便、血清和海馬體進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與移植 HC 糞菌的小鼠相比，移植 SCZ 糞菌小鼠的海馬區(qū)的谷氨酸鹽顯著降低，谷氨酰胺和 GABA 顯著增加。結(jié)果表明，SCZ 的腸道菌群可以通過(guò)與 SCZ 病理相關(guān)的方式改變神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)功能。
文章研究思路
文章研究思路流程圖
