多組學聯合分析，拿下CNS牛刊不是夢
以下文章轉載于果殼生物，原作者Jay
微生物群（Microbiota）是指特定時間及特定生境中所有微生物有機體的總稱，包括非細胞結構的病毒、原核生物中的細菌和古菌及真核細胞微生物。微生物組（Microbiome）是指特定時間及特定生境中微生物群所包含的基因序列（含同源序列總和）。近年來，針對環境微生物的研究，逐漸成為各個領域的研究熱點。目前基于環境微生物的測序策略主要包括微生物多樣性、宏基因組及宏轉錄組等多個產品。其中應用最廣泛的是微生物多樣性，目前在人體腸道菌群、皮膚、口腔、陰道、土壤、水體、空氣及發酵等研究領域被廣泛應用。
環境樣本中的微生物
近年來，基于微生物多樣性測序技術發表的文章呈現逐年攀升的趨勢，據不完全統計，2019年，僅細菌多樣性發表文章數量約達2700篇，截止2020年7月已經發表約1600篇。但是隨著測序技術的不斷完善和科研水平的日益提升，單一組學很難滿足科研需求，利用多組學聯合分析的手段解決科學問題已然是大勢所趨。小編基于文獻調研和多年的項目經驗，總結了關于微生物多樣性測序技術多組學文章的研究思路及其案例，希望對各位老師的科學研究有所幫助。
數據來源于NCBI，搜索關鍵詞“16S + diversity”
微生物多樣性
微生物多樣性測序技術是研究環境樣本中微生物的物種種類和豐度。
基于單獨的微生物多樣性測序數據發表的文章思路比較簡單，首先通過物種分布柱狀圖和α多樣性對環境樣本中物種的組成進行初步的分析。然后通過β多樣性宏觀分析不同樣本/組間是否存在差異，如果存在差異，通過Metastats和LEfSe分析找出導致不同樣本/組間微生物群落結構差異的關建菌，找到了關建菌之后就可以結合研究背景進行深入探討，也可以通過功能基因預測揭示在環境樣本中關鍵菌可能發揮著的功能和參與的代謝途徑等，從而來揭示科學問題。此外，可以結合生理生化指標進行RDA/CCA分析，從而明確生理生化指標和特定物種及樣本間的相關性。
微生物多樣性主要分析結果
微生物多樣性案例解析
Microbiome：農業管理和植物選擇相互作用影響根際微生物群落結構和氮循環
Agricultural management and plant selection interactively affect rhizosphere microbial community structure and nitrogen cycling，2019，Microbiome，DOI:10.1186/s40168-019-0756-9.
根際微生物群落是由農業管理和宿主選擇過程之間的相互作用形成的。本研究基于QIIME2分析流程探討農業管理(M)和根際效應(R)對長期常規管理和有機管理的玉米-番茄輪作農業生態系統中玉米根部微生物群落結構和共生網絡影響，揭示這些因素之間的相互作用及其影響根際微生物類群、共生網絡結構和微生物氮循環的過程。本研究對土壤樣本進行16S V4和ITS1多樣性測序，ASV分析結果顯示細菌和古菌多樣性受管理系統和土壤生態位的影響，真菌群落結構組成僅受管理影響，網絡結構僅受植物選擇影響。對氮循環功能基因進行qPCR，定量結果表明只有nosZ基因豐度受管理的影響，且在有機系統中豐度更高。
文章主要分析結果
微生物多樣性+宏基因組學
微生物多樣性，快速且經濟，由于PCR過程導致了偏好性，可能降低了注釋準確度。原核、真核生物的“分類標簽”完全不同，即使細菌和古菌的16S也有很大差異，病毒更難捕獲，且只能初步預測功能結構信息。宏基因組有效避免了擴增偏差，環境樣本中Total DNA被直接打斷，物種注釋更全面（細菌、真菌、古菌及真核生物等），此外，還可能組裝獲得新基因乃至新物種信息，主要側重于群落的功能結構研究。那么如何更高效、準確的了解微生物物種組成、多樣性、功能組成及豐度情況呢？采用16S和宏基因組聯合分析已經成為高分文章的主流思路。首先基于16S進行大樣本測序分析，宏觀篩選出不同條件樣本間物種種類和豐度差異比較大或者比較有代表性的樣本，進行宏基因組測序，不僅可以驗證16S的分析結論的準確性，還可以更加深入挖掘功能基因和代謝通路等，以此闡明群落的功能情況，更好的說明微生物群落與環境之間的關系。
微生物多樣性+宏基因組學研究思路
微生物多樣性+代謝組學
近年來，隨著微生物組學研究的不斷發展，很多界內大佬紛紛開始將微生物組學和代謝組學聯合起來，以期從物種、基因以及代謝產物等水平共同解釋科學問題，廣泛應用在醫學疾病腫瘤、中醫中藥、食品科學及畜牧水產等研究領域。微生物多樣性測序技術可以解決"who is there"（那有誰），宏基因組測序技術可以解決 "what are they doing"（在干嘛）的問題。而代謝組學是研究生物體中代謝產物變化的科學，常用研究方法包括了：LC/MS（液質聯用），GC/MS（氣質聯用）和NMR（核磁共振），可以解決"what have really happened"的問題。目前基于微生物多樣性+代謝組學關聯分析的研究思路，可參考下文案例。
微生物多樣性+代謝組學研究思路
微生物多樣性+代謝組學案例解析
Nature 子刊：人群隊列的腸道菌群和血液代謝物的關系
Relationship between gut microbiota and circulating metabolites in population-based cohorts，2019，Nature Communications，DOI: 10.1038/s41467-019-13721-1.
目前，很多研究報道揭示腸道菌群主要通過微生物的代謝和免疫信號進入循環系統，進而影響著人類的健康。研究表明肥胖、糖尿病、心血管疾病與腸道微生物密切關聯，微生物是循環血脂水平主要的驅動者。本研究主要基于Rotterdam（n = 1390，平均年齡56.9±5.9，女性57.5％）和 LifeLines-DEEP（n = 915，平均年齡44 ± 13.9，女性的58.7％）兩隊列的志愿者，進行糞便樣本16S V4細菌多樣性測序和血液樣本代謝物的檢測（NMR）。通過線性回歸分析評估腸道菌群與代謝物之間的關系，同時校正了年齡、性別、BMI、技術協變量、藥物使用及多項檢測。該研究結果找到了32個微生物科/屬與極低密度和高密度亞組分、血脂測定、糖酵解相關代謝物、酮體、氨基酸及急性反應標記物，為了解微生物群在宿主代謝中的作用提供理論依據。
校正了多種驗證，年齡，性別，體重指數，技術協變量，用藥后等，循環代謝物與腸道菌群之間的關聯分析
微生物多樣性+宏基因組學+代謝組學
人體與其共生的微生物組成了整個龐大而縝密的“個體”，與人體共生的微生物個數約100W億，而腸道菌群占據主要的人體微生物的組成，腸道微生物包括有益菌和有害菌，時刻影響著人體大腦的功能、情緒和行為。這些錯綜復雜且相互關聯的溝通交流途徑構成了我們所熟知的“腸腦軸”（MGB）。2019年，發表在《Physiol Review》雜志上題目為《The microbiota-gut-brain axis》的文章研究結果表明，腸道微生物通過腸-腦軸調控腦功能和行為。無菌動物、抗生素、糞菌移植、腦成像、測序和生物信息學等是主要研究手段。菌群-腸-腦軸在不同年齡階段呈現不同的微生物群落結構，腸道菌群與腦通過自主神經、腸神經、免疫系統、腸內分泌信號、神經遞質、支鏈氨基酸、膽汁酸、短鏈脂肪酸、脊髓、下丘腦-垂體-腎上腺軸、肽聚糖等途徑和介質進行雙向交流。環境、飲食、遺傳、壓力等因素影響菌群-腸-腦軸，菌群參與多種神經相關疾病。近年來，疾病與菌群-腸-腦軸（MGB）方向的研究逐漸火熱，在頂尖雜志上的報道均取得突破性進展。
文章主要分析結果
微生物多樣性+宏基因組學+代謝組學案例解析
Science 子刊：精神分裂癥患者潛在的菌群-腸-腦軸作用機制
The gut microbiome from patients with schizophrenia modulates the glutamate-glutamine-GABA cycle and schizophrenia-relevant behaviors in mice，2019，Science Advances，IF 11.511
腸道微生物可以通過菌群-腸-腦軸（MGB）調節腦功能和行為。研究表明，MGB的紊亂可能與 SCZ（精神分裂癥）的發生有關。為解析腸腦軸的發育是否與精神分裂癥有關，本研究首先基于健康人群（HCs）和精神分裂癥患者（SCZ）糞便樣本進行16S V3+V4細菌多樣性測序。發現SCZ與HCs相比，有明顯失調的腸道微生物，由Aerococcaceae、Bifidobacteriaceae、Brucellaceae、Pasteurellaceae和Rikenellaceae 組成的特定的微生物團體可以作為區分SCZ 和 HCs（AUC=0.769）的biomarker。其次，將SCZ和HCs的糞便移植到無菌小鼠體內驗證其腸道微生物功能，對移植兩周后的小鼠糞便進行宏基因組測序，發現與Control FTM小鼠相比，SCZ的FTM小鼠富集脂質和氨基酸代謝的基因會更多。同時，對小鼠糞便、血清和海馬體進行非靶向代謝組學檢測，發現與移植 HC 糞菌的小鼠相比，移植 SCZ 糞菌小鼠的海馬區的谷氨酸鹽顯著降低，谷氨酰胺和 GABA 顯著增加。結果表明，SCZ 的腸道菌群可以通過與 SCZ 病理相關的方式改變神經化學和神經功能。
文章研究思路
文章研究思路流程圖
