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文獻(xiàn)分享 | The EMBO Journal 新冠病毒免疫病理學(xué)和多器官損傷的血液分子標(biāo)志物
新冠肺炎(COVID-19)已鑒定為SARS-CoV-2病毒感染，表現(xiàn)為免疫應(yīng)答失去調(diào)節(jié)能力，代謝功能紊亂和多器官損傷。目前，新冠肺炎的全球疫情仍不容忽視，截至2021年6月27日，全球現(xiàn)存確診病例29526909例，累計(jì)死亡2889592例。2020年，國際知名期刊EMBO J發(fā)表了一項(xiàng)來自復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院的研究內(nèi)容，研究者對(duì)66例不同病程的新冠肺炎感染者的血液進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了在輕癥和重癥肺炎患者體內(nèi)，許多組織特異性蛋白和胞外RNA具有顯著改變。在肺炎向重癥發(fā)展的病程中，中性粒細(xì)胞，IFN信號(hào)通路呈現(xiàn)慢性激活，炎癥細(xì)胞因子水平升高；而輕癥患者表現(xiàn)為強(qiáng)健的T細(xì)胞效應(yīng)。這些結(jié)果是新冠肺炎發(fā)展和預(yù)后的重要指征，對(duì)了解預(yù)測新冠肺炎的病理生理學(xué)和疾病發(fā)展具有重要意義。
1. COVID-19 感染患者的免疫病理學(xué)變化
從66名不同病情的患者以及 17 名健康志愿者收集了血液和咽拭子樣本（圖1A）。為了確定 COVID-19 病理生理學(xué)是否與特定的分子變化相關(guān)，研究者結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的多組學(xué)方法檢查了總共 23,373 個(gè)表達(dá)基因、9,439 個(gè)蛋白質(zhì)、327 個(gè)代謝物和 769 個(gè) exRNA（圖 1B）。與健康對(duì)照相比，輕度和重度患者的表達(dá)基因有6.79%上調(diào)和26.0%的下調(diào)；這一表達(dá)模式（上調(diào)/下調(diào)）在蛋白質(zhì)水平為52.1%和51.7%，在代謝物水平為7.34%和15.6%，在exRNAs中為 39.9%和20.5%（圖 1C）。
圖1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果
值得注意的是，多組學(xué)數(shù)據(jù)與經(jīng)典血液和生化參數(shù)之間存在顯著相關(guān)性：輕癥和重癥患者的三羧酸循環(huán) (TCA) 和糖酵解途徑均顯著下調(diào)。然而，這些患者的缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF-1) 信號(hào)通路和宿主防御通路（T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、ISG15 抗病毒信號(hào)通路）升高（圖 2A）。此外，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 (WGCNA) 將蛋白質(zhì)組圖譜分成 33 個(gè)共表達(dá)模塊 (ME0-ME32)。其中，六個(gè)模塊顯示出與臨床參數(shù)的顯著相關(guān)性（圖 2B），特別是和活化部分凝血活酶時(shí)間 (APTT) 密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)可能表明 APTT 值較高（圖 2C）。相比之下，患者的血漿 IL-6 和 IL-10 水平與模塊 15 中的蛋白質(zhì)表達(dá)呈正相關(guān)（圖 2D）。除蛋白質(zhì)外，脂蛋白變異也與免疫變化顯著相關(guān)，包括 IgG、單核細(xì)胞和降鈣素原。綜合起來，這些數(shù)據(jù)表明特定分子變異與 COVID-19 感染患者的病理生理變化之間存在關(guān)聯(lián)。
圖2. 與COVID-19病理生理學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)水平改變
輕度和重度患者血漿中肺增強(qiáng)蛋白的差異很大。在所有患者中都觀察到 HIF-1 信號(hào)通路和活性氧代謝過程的激活（圖 3D）。肝和腦增強(qiáng)蛋白也有顯著差異，其次是來自睪丸、腸和其他器官的蛋白（圖 3A）。同時(shí)，研究者還觀察到調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成（GLS、OGDH、DLD 等）、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（GLUL、GLUD2、GLUD1）和神經(jīng)遞質(zhì)受體（HTRA3、GRIK3 和GRIA3)，以及包括 ENO1、MBP 和 NEFM 在內(nèi)的蛋白質(zhì)顯著減少（圖 3C 和 F）。調(diào)節(jié)甾醇和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的肝臟增強(qiáng)蛋白下調(diào)，而在輕度和重度患者中參與急性炎癥反應(yīng)的蛋白升高（圖 3E）。參與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的睪丸增強(qiáng)蛋白在所有男性患者中均上調(diào)，盡管與生殖相關(guān)的蛋白（例如 YBX2）顯著下調(diào)。在 COVID-19 感染患者中，與心肌收縮和氧化還原相關(guān)的心臟特異性蛋白質(zhì)減少（圖 4C）。
圖3. COVID-19患者組織特異性蛋白質(zhì)改變
研究者還研究了不同細(xì)胞群的相對(duì)比例和組織損傷相關(guān) exRNA 的表達(dá)。（圖 4A 和 B）。例如，肺泡 1/2 型上皮細(xì)胞（AT1 和 AT2）表達(dá)的一組蛋白質(zhì)在所有患者中均顯著下調(diào)（圖 4B）。此外，在所有組織中，大多數(shù)與組織損傷相關(guān)的 exRNAs 顯示出差異表達(dá)。一些組織增強(qiáng)蛋白和組織損傷相關(guān) exRNA 的變異也與 COVID-19 的嚴(yán)重程度有關(guān)。例如，富含微管蛋白積累的腦增強(qiáng)蛋白在輕度疾病患者中上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明 COVID-19 可能影響多個(gè)器官。
圖4. COVID-19患者組織損傷
3. COVID-19 感染患者免疫病理學(xué)變化
全血轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，在整個(gè)住院期間，重癥患者的 IFN 信號(hào)持續(xù)激活（圖 5A），與輕度患者相比，重癥患者的 IL-6、IL-8 和 IL-10 水平顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明 IFN-I 信號(hào)的持續(xù)激活和高水平的炎性細(xì)胞因子可能會(huì)影響 COVID-19 的免疫病理學(xué)。
對(duì)中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征的檢查表明，中性粒細(xì)胞過度激活與嚴(yán)重而非輕度疾病有關(guān)。值得注意的是，編碼與中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）相關(guān)分子的基因在嚴(yán)重疾病患者中顯著上調(diào)（圖 5B）。由于過量的 NET 形成會(huì)導(dǎo)致組織損傷，研究者的數(shù)據(jù)表明中性粒細(xì)胞的過度激活可能有助于 COVID-19 的發(fā)病機(jī)制。
與可以通過強(qiáng) T 細(xì)胞反應(yīng)清除的流感病毒一樣，輕癥患者的 SARS-CoV-2 免疫力的特點(diǎn)是強(qiáng)大的 T 細(xì)胞反應(yīng)，反映在入院時(shí) T 細(xì)胞信號(hào)激活（M7.3 模塊、M35.1 模塊）和 T 細(xì)胞分化（M19 模塊），隨后迅速減少（圖 5A））。表明T 細(xì)胞反應(yīng)對(duì)于成功抵御 SARS-CoV-2 的宿主防御是必不可少的。
圖5. COVID-19患者免疫應(yīng)答差異
4. COVID-19感染患者脂蛋白代謝的綜合變化
為了揭示 COVID-19 感染患者的代謝變化，研究者量化了代謝物、脂蛋白亞類的 348 個(gè)代謝物參數(shù)。PCA 評(píng)分圖顯示出明顯的與病程變化相關(guān)的代謝組學(xué)軌跡（圖 6A）。因此，血漿代謝物的濃度變化與 COVID-19 的嚴(yán)重程度有關(guān)。
進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析突出了脂蛋白亞類及其組成成分的主要變化，包括 LDL1 (L1TG)、LDL4、VLDL5、HDL1 和 HDL4（圖 6C ）。與健康對(duì)照組相比，輕度和重度患者的LDL1中的甘油三酯（TG）和VLDL5所有脂質(zhì)中的游離膽固醇（FC）水平均顯著升高，而LDL4和LDL5、LDL中的膽固醇、膽固醇酯均顯著降低。幸運(yùn)的是，大多數(shù)這些脂蛋白在患者出院后恢復(fù)（圖 6B和C).
參與脂蛋白代謝的一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)，包括可溶性低密度脂蛋白受體 (sLDLR)、卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶 (LCAT) 和膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白 (CETP)，在輕度和重度 COVID-19 中顯著降低。（圖 6D 和 E）。此外，與健康對(duì)照組相比，在 TCA 循環(huán)中的 ACO2、IDH、OGDH、DLD、SDH 和 MDH 等酶在 COVID-19 感染患者中較低，而對(duì)脂肪酸合成至關(guān)重要的酶（乙酰輔酶 A 羧化酶 [ACAC ] 和脂肪酸合成酶 [FASN]) 升高。與健康對(duì)照相比，在患者中可以觀察到血漿乳酸和 LDH 的顯著同時(shí)升高（圖 6E）。這些數(shù)據(jù)揭示了 SARS-CoV-2 感染期間脂蛋白代謝、糖酵解和 TCA 循環(huán)的失調(diào)。
圖6. COVID-19患者血漿代謝組差異
5. 病毒載量與嚴(yán)重 COVID-19 感染患者的疾病預(yù)后相關(guān)
COVID-19 的嚴(yán)重程度和臨床結(jié)果也與病毒載量有關(guān)。總體而言，與存活者相比，入院時(shí) 5 例死亡病例咽拭子中的 SARS-CoV-2 RNA 載量顯著更高（圖 7A）。參與抗病毒過程的蛋白質(zhì)，包括 TCR 和 BCR 信號(hào)通路，與重癥幸存者的病毒載量變化呈正相關(guān)。此外，參與病毒生命周期過程的蛋白質(zhì)，包括病毒mRNA 合成和先天免疫反應(yīng)，僅與重癥致死組的病毒載量變化呈正相關(guān)（圖 7E）。值得注意的是，重癥存活組中涉及線粒體功能、脂質(zhì)代謝過程、類固醇激素過程和 TCA 循環(huán)等途徑的蛋白質(zhì)（例如，FASN、ACSS2、CPT1A、HADHB）持續(xù)上調(diào)（圖 7B和 C）。然而，這種上調(diào)僅在重癥致死組入院后的早期階段觀察到。令人驚訝的是，與病毒生命周期、病毒 RNA 合成和氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)（例如，EIF、EIFB、RPL19、SLCA24）在入院后的幾個(gè)幸存者病例中下調(diào)，但在死亡患者中保持高水平（圖 7B 和 D )。因此，SARS-CoV-2 可能會(huì)在感染期間利用宿主資源。
圖7. COVID-19重癥患者預(yù)后對(duì)比分析
6. 預(yù)測 COVID-19 感染患者臨床結(jié)果的生物標(biāo)志物
由于發(fā)現(xiàn)了許多與 COVID-19 病理生理學(xué)相關(guān)的分子表型，研究者利用第一時(shí)間點(diǎn)或所有時(shí)間點(diǎn)的 exRNA、mRNA、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床協(xié)變量數(shù)據(jù)集，構(gòu)建預(yù)測模型。PCA聚集成三種臨床表型：（i）健康組；(ii) 感染患者且預(yù)后良好；(iii)感染患者且預(yù)后較差（圖 8A）。基于所有四種類型數(shù)據(jù)的預(yù)測模型運(yùn)行良好，表明入院時(shí)收集的所有四種類型的數(shù)據(jù)都包含關(guān)鍵的預(yù)后信息。
此外，研究者從四種類型的數(shù)據(jù)中各自確定了穩(wěn)健的預(yù)測模型和生物標(biāo)志物。每個(gè)數(shù)據(jù)集中的一兩個(gè)特征（表達(dá)的基因、蛋白質(zhì)、exRNA 和生化參數(shù)）能夠清楚地將患者分為具有不同預(yù)后特征的兩組（圖 8D-I）。預(yù)后不良與 D-二聚體和纖維蛋白原降解產(chǎn)物水平升高以及 F13A1 表達(dá)降低有關(guān)（圖 8H 和 I)，表明凝血狀態(tài)可能是監(jiān)測 COVID-19 進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一。基于 mRNA 的模型顯示不良預(yù)后與較低水平的 CD3E 和較高水平的 OLAH 相關(guān)，因此與 COVID-19 感染患者的免疫反應(yīng)高度一致（圖 8E）。此外，基于 exRNA 的預(yù)測因子包括 let-7 家族的成員（圖 8D 和 E）。最后，基于蛋白質(zhì)的模型突出了富含細(xì)胞外外泌體、脂蛋白代謝過程、先天免疫反應(yīng)和血液凝固的特征（圖8G 和 H）。
圖8. COVID-19患者預(yù)后預(yù)測模型
COVID-19 的嚴(yán)重程度和臨床結(jié)果與多器官損傷顯著相關(guān)。由于 ACE2廣泛存在，SARS-CoV -2 能夠感染許多器官。除了肺炎，多項(xiàng)臨床研究報(bào)告了住院 COVID-19 感染患者的輕度胃腸道、心血管癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。組織病理學(xué)調(diào)查和尸檢也記錄了除肺以外的其他器官的損傷。
SARS-CoV-2 感染會(huì)導(dǎo)致患者發(fā)生急性肺損傷 (ALI)，本研究數(shù)據(jù)顯示，重癥患者的 AT1 和 AT2 細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明肺泡上皮遭到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致肺泡液積聚，進(jìn)而引發(fā)缺氧；此外， HIF1a 信號(hào)改變，這可能會(huì)進(jìn)一步惡化 ALI。因此，去除多余的肺泡液和恢復(fù)肺泡結(jié)構(gòu)將具有重要的臨床意義。
在另一方面，免疫病理生理學(xué)是一個(gè)極大影響 COVID-19 臨床結(jié)果的因素。本研究縱向分析提供的證據(jù)表明，T 細(xì)胞動(dòng)員成功的輕度或重度癥狀患者迅速控制了病情。相比之下，未能產(chǎn)生良好 T 細(xì)胞反應(yīng)的重癥患者保持持續(xù)的促炎反應(yīng)，并遭受細(xì)胞因子風(fēng)暴和過量的 NETs。
值得注意的是，與輕度和重度存活患者相比，p38信號(hào)，膠原酶（MMP9），嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)-引誘（CXCL2和CXCL6）和S100A8這些炎癥分子在重度致死患者中顯著上調(diào)，前者也表現(xiàn)出 I 型干擾素反應(yīng)的持續(xù)升高。總之，在非常嚴(yán)重的 COVID-19 病例中，自身炎癥可能會(huì)放大疾病。缺乏來自其他呼吸道病原體的控制可能是這項(xiàng)研究的局限性，因此無法確信這些分子改變是否是COVID-19獨(dú)有，SARS-CoV-2 的病理學(xué)和病理生理學(xué)及其與其他呼吸道病原體的差異值得進(jìn)一步研究。
在這項(xiàng)研究中，在 COVID-19 開始階段發(fā)現(xiàn)的一些分子與經(jīng)典血液和生化參數(shù)顯著相關(guān)，更重要的是與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。研究者分別建立了對(duì)于exRNAs、mRNA、蛋白質(zhì)和生化參數(shù)的預(yù)測模型。在每種數(shù)據(jù)類型中僅使用一兩個(gè)生物標(biāo)志物就可以準(zhǔn)確預(yù)測 COVID-19 的臨床結(jié)果。此外，這些生物標(biāo)志物可能具有與 COVID-19 病理生理學(xué)直接相關(guān)的生物學(xué)功能。例如，來自 exRNAs 的 let-7 家族、來自 mRNA 的 OLAH 和 CD3E 以及來自蛋白質(zhì)組的 C4A 和 C4B 一致地揭示了 T 細(xì)胞活化和抑制炎癥反應(yīng)的重要性。然而，由于這里使用的患者樣本量相對(duì)較小，顯然需要做更多的工作來確認(rèn)這些生物標(biāo)志物的可靠性和實(shí)用性，尤其是在更大的隊(duì)列中驗(yàn)證這些生物標(biāo)志物的預(yù)測能力。
文章轉(zhuǎn)自微信公眾號(hào)iMetabolome
