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干貨分享 | 氣相色譜衍生化方法大PK
氣相色譜（GC）是利用物質(zhì)的沸點(diǎn)、極性及吸附性質(zhì)的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)混合物的分離，適合分析具有揮發(fā)性且穩(wěn)定性高的物質(zhì)，對(duì)于一些高沸點(diǎn)或者穩(wěn)定性差的物質(zhì)分析困難。衍生化是GC分析中常用的樣品處理技術(shù)，是將難于分析的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似但易于分析的物質(zhì)，具有提高物質(zhì)的揮發(fā)性和穩(wěn)定性、改善色譜的峰形、改善分離性能和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。GC分析中常見(jiàn)的衍生化方法主要有烷基化反應(yīng)、硅烷化反應(yīng)、酰化反應(yīng)，具體選擇哪一種要根據(jù)被分析物的反應(yīng)基團(tuán)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡榷喾矫婢C合判斷。
烷基化反應(yīng)
烷基化反應(yīng)是衍生試劑分子中的烷基取代分析物中的活性氫（-OH、-COOH、-SH、-NH和-CONH），反應(yīng)式如下：
烷基化反應(yīng)常用的衍生試劑有二烷基化合物、重氮烷、五氟苯溴（PFBBr）、溴化芐、甲醇或丁醇中的三氟化硼（BF3）和四丁基氫氧化銨（TBH）等。烷基化試劑可單獨(dú)用于生成酯類、醚類和酰胺類，也可與酰基化或硅基化試劑結(jié)合使用。反應(yīng)條件通常比較嚴(yán)苛，從強(qiáng)酸到強(qiáng)堿都能生成穩(wěn)定的衍生物，反應(yīng)過(guò)程使用的試劑往往具有毒性。
硅烷化反應(yīng)
硅烷化是氣相色譜分析中最普遍的衍生化方法，是將一個(gè)硅基引入分子中，通常用三甲基硅基取代活性氫（-OH、-COOH、-NH、-NH2和-SH基團(tuán)），反應(yīng)式如下：
常用的硅烷化試劑有：六甲基二硅烷（HMDS），三甲基氯硅烷（TMCS)，三甲基硅咪唑（TMSI），雙三甲基硅基乙酰胺（BSA）、雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）、n -甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）、三甲基硅基二乙胺（TMS-DEA）、n-n-t-丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBSTFA），其中BSTFA和MSTFA兩種試劑應(yīng)用最廣。在硅烷化反應(yīng)中，硅烷化試劑一般對(duì)水分敏感，必須注意確保樣品和溶劑都是干燥的，使用的溶劑應(yīng)盡量純凈和少，吡啶是最常用的溶劑，能促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，一般情況下，硅烷化反應(yīng)不再需要其他試劑，否則易產(chǎn)生污染。
酰化反應(yīng)
酰化也是一種常見(jiàn)的衍生方法，是一種將酰基引入有機(jī)化合物的反應(yīng)。含有活性氫的化合物（如-OH、-SH和-NH）可以通過(guò)酰基化分別轉(zhuǎn)化為酯、硫酯和酰胺，反應(yīng)式如下：
酰基化衍生試劑主要有酰鹵、酸酐、酰基咪唑、酰胺和烷基氯甲酸酯等，常使用乙腈，吡啶，DMSO或四氫呋喃等溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)。
應(yīng)用
氣相色譜（GC）或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）是目前代謝組學(xué)中常用的分析工具，已廣泛應(yīng)用于生物樣本中脂肪酸等代謝物的分析，脂肪酸分析中常用到的衍生化方法有甲酯化（烷基化）和硅烷化。
1）脂肪酸組成（脂肪酸譜）分析
即單個(gè)脂肪酸在總脂肪酸中所占的百分比，它強(qiáng)調(diào)了復(fù)雜脂質(zhì)池中脂肪酸之間的代謝競(jìng)爭(zhēng)，受到飲食和代謝的影響。總脂肪酸包含磷脂、三酰基甘油、膽固醇酯中的結(jié)合型脂肪酸和游離脂肪酸。我司建立一種以甲醇和乙酰氯為原料的甲酯化衍生、GC檢測(cè)生物樣本（如細(xì)胞、組織、血液）中脂肪酸組成（脂肪酸譜）的方法。
2）游離脂肪酸（FFA）分析
FFA在生物調(diào)控中發(fā)揮著多種關(guān)鍵功能，是膜脂的重要組成部分，參與膜介導(dǎo)的細(xì)胞功能，在各種信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)生物代謝。我司建立了BSTFA為原料硅烷化衍生、GC-MS檢測(cè)生物樣本（如細(xì)胞、組織、血液）中FFA方法。
3）短鏈脂肪酸（SCFA）分析
SCFA作為膳食纖維經(jīng)腸道菌群發(fā)酵的產(chǎn)物，已被發(fā)現(xiàn)影響結(jié)腸的形態(tài)和功能，還可以調(diào)節(jié)全身免疫，發(fā)揮抗炎作用。我司建立一種以氯甲酸酯和異丁醇為原料衍生的氯甲酸異丁基化衍生（酰基化）、GC-MS分析生物樣本（如糞便、血液）中 SCFA方法。
有沒(méi)有細(xì)心的讀者發(fā)現(xiàn)，同樣是脂肪酸，同樣是GC分析，我司選擇的衍生化方法居然完全不同，這是為什么呢？用同一種方法難道不是最省事的嗎？
下面，我們就對(duì)原因進(jìn)行大揭密！測(cè)脂肪酸組成時(shí)，由于要先把結(jié)合型脂肪酸水解為FFA，酯基的水解須用酸或堿催化，乙酰氯-甲醇（甲酯化）體系反應(yīng)后產(chǎn)生的鹽酸能促進(jìn)脂水解，產(chǎn)生的乙酸甲酯則與羧基酯交換形成終產(chǎn)物脂肪酸甲酯，物盡其用，非常高效。測(cè)FFA時(shí)，甲酯化衍生的方法可能使樣品中的結(jié)合型脂肪酸水解為FFA，從而導(dǎo)致FFA定量不準(zhǔn)，而硅烷化衍生不存在這種情況，并且具有產(chǎn)物易制備、穩(wěn)定性好、在儀器上響應(yīng)高等優(yōu)點(diǎn)，是非常好的選擇。對(duì)于SCFA來(lái)說(shuō)，由于SCFA的高揮發(fā)性，常規(guī)的衍生化方法如甲酯化或硅烷化易造成SCFA組分丟失，可導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確，而氯甲酸異丁基化衍生過(guò)程條件溫和、無(wú)需去水、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性好，是最佳選擇。
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