干貨分享 | 氣相色譜衍生化方法大PK
氣相色譜（GC）是利用物質的沸點、極性及吸附性質的差異來實現混合物的分離，適合分析具有揮發性且穩定性高的物質，對于一些高沸點或者穩定性差的物質分析困難。衍生化是GC分析中常用的樣品處理技術，是將難于分析的物質轉化為與其化學結構相似但易于分析的物質，具有提高物質的揮發性和穩定性、改善色譜的峰形、改善分離性能和靈敏度等優點。GC分析中常見的衍生化方法主要有烷基化反應、硅烷化反應、酰化反應，具體選擇哪一種要根據被分析物的反應基團、實驗目的等多方面綜合判斷。
烷基化反應
烷基化反應是衍生試劑分子中的烷基取代分析物中的活性氫（-OH、-COOH、-SH、-NH和-CONH），反應式如下：
烷基化反應常用的衍生試劑有二烷基化合物、重氮烷、五氟苯溴（PFBBr）、溴化芐、甲醇或丁醇中的三氟化硼（BF3）和四丁基氫氧化銨（TBH）等。烷基化試劑可單獨用于生成酯類、醚類和酰胺類，也可與酰基化或硅基化試劑結合使用。反應條件通常比較嚴苛，從強酸到強堿都能生成穩定的衍生物，反應過程使用的試劑往往具有毒性。
硅烷化反應
硅烷化是氣相色譜分析中最普遍的衍生化方法，是將一個硅基引入分子中，通常用三甲基硅基取代活性氫（-OH、-COOH、-NH、-NH2和-SH基團），反應式如下：
常用的硅烷化試劑有：六甲基二硅烷（HMDS），三甲基氯硅烷（TMCS)，三甲基硅咪唑（TMSI），雙三甲基硅基乙酰胺（BSA）、雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）、n -甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）、三甲基硅基二乙胺（TMS-DEA）、n-n-t-丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBSTFA），其中BSTFA和MSTFA兩種試劑應用最廣。在硅烷化反應中，硅烷化試劑一般對水分敏感，必須注意確保樣品和溶劑都是干燥的，使用的溶劑應盡量純凈和少，吡啶是最常用的溶劑，能促進反應的進行，一般情況下，硅烷化反應不再需要其他試劑，否則易產生污染。
酰化反應
酰化也是一種常見的衍生方法，是一種將酰基引入有機化合物的反應。含有活性氫的化合物（如-OH、-SH和-NH）可以通過酰基化分別轉化為酯、硫酯和酰胺，反應式如下：
酰基化衍生試劑主要有酰鹵、酸酐、酰基咪唑、酰胺和烷基氯甲酸酯等，常使用乙腈，吡啶，DMSO或四氫呋喃等溶劑作為反應介質。
應用
氣相色譜（GC）或氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）是目前代謝組學中常用的分析工具，已廣泛應用于生物樣本中脂肪酸等代謝物的分析，脂肪酸分析中常用到的衍生化方法有甲酯化（烷基化）和硅烷化。
1）脂肪酸組成（脂肪酸譜）分析
即單個脂肪酸在總脂肪酸中所占的百分比，它強調了復雜脂質池中脂肪酸之間的代謝競爭，受到飲食和代謝的影響。總脂肪酸包含磷脂、三酰基甘油、膽固醇酯中的結合型脂肪酸和游離脂肪酸。我司建立一種以甲醇和乙酰氯為原料的甲酯化衍生、GC檢測生物樣本（如細胞、組織、血液）中脂肪酸組成（脂肪酸譜）的方法。
2）游離脂肪酸（FFA）分析
FFA在生物調控中發揮著多種關鍵功能，是膜脂的重要組成部分，參與膜介導的細胞功能，在各種信號通路中發揮重要作用，調節生物代謝。我司建立了BSTFA為原料硅烷化衍生、GC-MS檢測生物樣本（如細胞、組織、血液）中FFA方法。
3）短鏈脂肪酸（SCFA）分析
SCFA作為膳食纖維經腸道菌群發酵的產物，已被發現影響結腸的形態和功能，還可以調節全身免疫，發揮抗炎作用。我司建立一種以氯甲酸酯和異丁醇為原料衍生的氯甲酸異丁基化衍生（酰基化）、GC-MS分析生物樣本（如糞便、血液）中 SCFA方法。
有沒有細心的讀者發現，同樣是脂肪酸，同樣是GC分析，我司選擇的衍生化方法居然完全不同，這是為什么呢？用同一種方法難道不是最省事的嗎？
下面，我們就對原因進行大揭密！測脂肪酸組成時，由于要先把結合型脂肪酸水解為FFA，酯基的水解須用酸或堿催化，乙酰氯-甲醇（甲酯化）體系反應后產生的鹽酸能促進脂水解，產生的乙酸甲酯則與羧基酯交換形成終產物脂肪酸甲酯，物盡其用，非常高效。測FFA時，甲酯化衍生的方法可能使樣品中的結合型脂肪酸水解為FFA，從而導致FFA定量不準，而硅烷化衍生不存在這種情況，并且具有產物易制備、穩定性好、在儀器上響應高等優點，是非常好的選擇。對于SCFA來說，由于SCFA的高揮發性，常規的衍生化方法如甲酯化或硅烷化易造成SCFA組分丟失，可導致定量結果不準確，而氯甲酸異丁基化衍生過程條件溫和、無需去水、衍生產物穩定性好，是最佳選擇。
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