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客戶文章 | Nutrients阿爾茨海默癥與腸道菌群
阿爾茨海默癥（AD）是全球老年人致殘或死亡的主要原因之一，已成為一個(gè)嚴(yán)重的健康問題。根據(jù)《世界阿爾茨海默癥報(bào)告》，目前有超過5000萬人患有癡呆癥，預(yù)計(jì)到2050年，這些患者的數(shù)量將達(dá)到1.52億。其中，有約60%-70%為AD患者。AD通常分為三個(gè)階段：輕度、中度認(rèn)知障礙（MCI）和重度癡呆。AD的早期診斷有助于改善AD的治療和康復(fù)。
2021年1月，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院傳染病診治協(xié)同創(chuàng)新中心王保紅團(tuán)隊(duì)在Nutrients（IF 5.717）上發(fā)表文章“Altered Gut Microbial Metabolites in Amnestic Mild Cognitive Impairment and Alzheimer’s Disease: Signals in Host–Microbe Interplay”，該研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，AD組的色氨酸代謝產(chǎn)物、短鏈脂肪酸（SCFA）和石膽酸（LCA）有顯著差異，色氨酸的代謝產(chǎn)物吲哚-3-丙酮酸有望作為鑒定和預(yù)測AD的標(biāo)志物，另有5種短鏈脂肪酸可作為AD發(fā)生和進(jìn)展的標(biāo)志物，從而為AD的預(yù)防和治療提供了潛在靶點(diǎn)和干預(yù)方式。我公司參與了該研究中短鏈脂肪酸（SCFA）和膽汁酸（BA）的定量檢測工作。原文鏈接：https://doi.org/10.3390/nu13010228。
研究方法
1.隊(duì)列設(shè)計(jì)：該研究招募了77名參與者，包括22名遺忘性輕度認(rèn)知障礙患者（aMCI組）、27名癡呆性阿爾茨海默癥患者（AD組）以及28名認(rèn)知正常的健康對照（HC組）。收集參與者的血清及新鮮糞樣進(jìn)行代謝物分析。
2.非靶向的代謝組學(xué)分析：對糞樣進(jìn)行預(yù)處理后通過UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS進(jìn)行非靶向代謝組分析。
3.靶向代謝組分析：對糞樣中的腸道微生物代謝產(chǎn)物，如色氨酸相關(guān)代謝物、SCFA（GC-MS檢測）、BA（UPLC-MS檢測）進(jìn)行靶向精準(zhǔn)定量分析。
4.分光光度法：對血清的脂多糖（LPS）進(jìn)行測定。
研究結(jié)果
1、AD、aMCI和HC組的代謝特征
發(fā)病前aMCI組和AD組糞樣的代謝表型與HC組有顯著分離，aMCI組和AD組之間也顯示出分離趨勢（下圖a，PCA模型）。進(jìn)一步，基于篩選出的25種差異代謝物構(gòu)建模型，發(fā)現(xiàn)三組之間顯著分開（下圖b，PLS-DA模型），而AD組主要的代謝表型改變是色氨酸代謝紊亂。
2、AD組色氨酸的代謝紊亂
根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫分析色氨酸代謝途徑的所有代謝物后，檢測并了9種色氨酸代謝物。這些代謝物涉及三個(gè)途徑，包括發(fā)生在宿主中，及發(fā)生在腸道中的吲哚衍生物途徑，這些過程都在腸道微生物的直接或間接控制下。發(fā)現(xiàn)AD組中通過宿主代謝的色氨酸-犬尿氨酸途徑?jīng)]有發(fā)生變化（下圖a,d），但在AD組中血清素代謝途徑中的代謝物顯著減少（下圖b，d）。例如，與HC組相比，5-羥基色氨酸（5-HTP）和DL-5-甲氧基色氨酸（DL-5-MTP）在aMCI組和AD組中降低。這些結(jié)果表明，在AD組中，宿主和微生物共同參與的色氨酸代謝受到了顯著干擾。此外，還發(fā)現(xiàn)腸道菌群代謝的色氨酸-吲哚衍生物途徑明顯受到干擾（下圖2c，d）。例如，與HC組相比，吲哚-3-丙酮酸（IPYA）在aMCI組和AD組中增加（p<0.05）。值得注意的是，與HC組相比，作為芳基烴受體（AhR）配體的吲哚衍生物在aMCI組和AD組中均顯著減少（p<0.01）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在AD組中，腸道菌群代謝的色氨酸途徑受到顯著干擾，尤其是作為AhR配體的吲哚衍生物。
3、AD組糞樣中SCFA與BA的改變
基于GC-MS對腸道微生物的代謝產(chǎn)物SCFA進(jìn)行了靶向分析，共檢測到8種SCFA。與HC組相比，有7種SCFA在aMCI組和AD組中顯著降低（p<0.05）（下圖a）。此外，甲酸、乙酸、丙酸、2-甲基丁酸和異戊酸這5種SCFA，在aMCI組和AD組之間有顯著差異（p<0.05）。這些結(jié)果表明，糞樣中SCFA的變化與AD的進(jìn)展有關(guān)。
此外還分析了腸道微生物的另一類重要代謝產(chǎn)物BA，對30個(gè)糞樣中的BA進(jìn)行了靶向定量檢測，共檢測到18種初級(jí)和次級(jí)膽汁酸（下圖b）。值得注意的是，只有細(xì)胞毒性作用的石膽酸（LCA）顯示出從HC組到aMCI組和AD組的逐漸下降趨勢。
4、AD組紊亂的腸道微生物與代謝物的關(guān)系
用Spearman分析了AD組中紊亂的腸道微生物與特征代謝物（包括DL-5MTP、IPYA、LCA和SCFA）之間的關(guān)聯(lián)（下圖a），紅色連線表示顯著正相關(guān)，綠色連線表示顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)果顯示，一些微生物僅與單一代謝物有關(guān)聯(lián)，例如，Lachnospiraceae和2-甲基丁酸相關(guān)；一些微生物具有多重相關(guān)性，如Clostridia與DL-5-MTP、甲酸和2-甲基丁酸存在顯著相關(guān)性。
此外，由于AD組中SCFA的濃度發(fā)生了顯著變化，該研究還對HC、aMCI和AD三組糞樣中15種可產(chǎn)生SCFA的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)與aMCI組或HC相比，AD組具有產(chǎn)SCFA能力的Clostridia數(shù)量顯著減少；與AD組和HC組相比，aMCI患者中產(chǎn)生丙酸的Bacteroides增多（下圖b）。產(chǎn)生SCFA的細(xì)菌數(shù)量和糞樣中SCFA濃度變化一致，證明AD組腸道中Firmicutes、Clostridia和Clostridiale的減少可能導(dǎo)致SCFA的降低。
5、AD組血清中內(nèi)毒素水平升高
鑒于促炎性脂多糖（LPS）在認(rèn)知障礙中的作用，該研究測定了外周血中的LPS水平。與HC組相比，aMCI和AD組血清中LPS有增加的趨勢。這些結(jié)果表明，aMCI和AD組都容易出現(xiàn)“腸道滲漏”。
6、AD組代謝表型與認(rèn)知障礙的關(guān)系
通過分析AD組的代謝表型與反映疾病嚴(yán)重程度（CDR）、認(rèn)知功能（MMSE和MoCA）參數(shù)的相關(guān)性（下圖a,b）。研究發(fā)現(xiàn)認(rèn)知障礙（MoCA）的升高與5-羥基色氨酸（5-HTP）及SCFA的減少呈正相關(guān)，而與吲哚-3-丙酮酸的增加呈負(fù)相關(guān)；降低的SCFA與CDR的升高呈負(fù)相關(guān)（p<0.05）；吲哚衍生物（5-羥基吲哚和吲哚-2-羧酸）和SCFA（包括2-甲基丁酸和異戊酸）與認(rèn)知障礙呈正相關(guān)（p<0.05）。此外，AD組糞樣中的代謝物與認(rèn)知障礙（MoCA和MMSE）之間存在顯著相關(guān)性（下圖b）。這些結(jié)果表明，AD組紊亂的代謝表型（腸道微生物相關(guān)）與認(rèn)知障礙相關(guān)。
7、根據(jù)糞樣中代謝表型可對AD、aMCI和HC組進(jìn)行區(qū)分
從AD組發(fā)生變化的14種代謝物（腸道微生物相關(guān)）中，篩選出包括IPYA和5種SCFA在內(nèi)的6種潛在生物標(biāo)記物。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)6種代謝物可有效區(qū)分aMCI、AD和HC組（下圖a，b）。
總結(jié)
該研究成果展示了利用代謝組學(xué)技術(shù)有望發(fā)現(xiàn)AD的早期診斷標(biāo)志物，糞樣中的代謝表型檢測是一種非侵入性的便捷方式。同時(shí)也為AD干預(yù)治療措施的研究提供了新的思路，干預(yù)腸道菌群及其代謝表型可能是未來的一個(gè)重要突破口。
