新文速遞丨Ind Crops Prod元素組評價草果道地性
草果干燥的成熟果實或種子是東亞和東南亞，特別是中國重要的食品添加劑、香料和藥物，地理產地關系到它的整體品質和商業價值。復旦大學人類表型組研究院、云南中醫藥大學以及河南中醫藥大學合作，通過ICP-MS建立了一種定量元素組學方法，構建了包括58種元素的草果種子元素譜，發現草果所含常量必需元素均值范圍較窄，非必需元素除Na、S、Cr外均呈現較寬范圍。32種元素（Li，B，Na，Mg，Al，Si，P，S，K，Ca，V，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，Ge，As，Rb，Sr，Mo，Ag，Cd，Sn，Cs，Ba，La，Ce，W，Pb）的多元素指紋圖譜及十五種元素（B，Mg，Al，P，S，K，Ca，V，Mn，Fe，Co，Ni，Sr，Mo，Ba）濃度的組合可用于判斷草果種子道地性。相關研究成果于2023年1月發表在Industrial Crops & Products雜志上，文章標題為“Multi-element fingerprinting approach for geographical authentication of Amomum tsaoko seed”，原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669023001097。
研究背景
草果為姜科多年生草本植物，其干燥成熟的果實或種子是東亞和東南亞重要的食品添加劑和香料，在中國常用于治療寒濕內阻、脘腹脹痛、脹滿嘔吐、瘧疾寒熱、瘟熱等。近年來，由于消費增加和草果野生種群的逐漸消失，草果的人工栽培面積有所增加，而草果的質量通常受產地的影響。基于元素組成的指紋圖譜方法已被廣泛用于道地性研究，目前幾乎沒有關于草果中元素含量的報道，此外草果中元素濃度水平之間的相關性也尚不清楚。本研究利用ICP-MS建立了一種有效的定量元素組學技術，研究來自12個產地（表1）的草果種子道地性。
表1. 草果產地等信息
研究結果
1.元素概況
草果樣品中元素檢出情況如圖1所示，常量必需元素是維持植物生長和完成其生命周期所需的基本元素，表現出較窄的范圍。草果種子常量必需元素的平均質量分數由大到小依次為：Cu > Zn > K > Ni > B > Mg > P > Ca > Mn > Fe > Mo。相比之下，非必需元素除了Na、S和Cr（圖 2 A）之外，尤其是Ba、Ti、Br、Sn、Cl、Zr、Ga、Y、Ag、Tl、Nb、U、Th、Bi、Hf、Au，呈現較寬范圍。重金屬分布于植物的各個部位，通過食物鏈影響人體健康。當重金屬在體內蓄積時，可能會競爭性取代必需元素，比如Cd會取代存在于金屬硫蛋白中的Zn，從而導致Zn代謝紊亂，抑制細胞中自由基清除。此外，重金屬的積累導致抗氧化失衡并影響酶的功能和多種激素的活性，As（主要是無機As）、Cd、Hg和Pb具有很強的毒性，可能對人類和動物的健康產生不利影響。
圖1. 所有樣品都檢測到加粗黑色字體（有色背景）所示的元素，其中淺黃色背景黑色字體元素（Be, Se, Ru, Rh, Pd, Te, Ta, Re, Os, Ir, Pt）在所有樣品中低于定量限（LOQ）
FAO/WHO食品添加劑聯合專家委員會確定了角叉菜中As、Cd、Hg和Pb的最高含量（As < 3×103 µg/kg，Cd < 2×103 µg/kg，Hg < 1×103 µg/kg，Pb < 5×103 µg/kg），中國藥典委員會確定了19種草藥中As、Cd、Hg和Pb的最高含量（As < 2×103 µg/kg，Cd < 1×103 µg/kg，Hg < 2×102 µg/kg，Pb < 5×103 µg/kg）。在本研究中，As含量范圍為20.3-52.5 µg/kg，Cd為16.3-117.1 µg/kg，Pb為8.8-42.5 µg/kg。同時，汞的水平描繪了種群之間的明顯分離。在GS、FG、PB、JP和TC這些產地的草果中，所有樣品汞含量均低于LOQ。YY的水平最高，為117.1 µg/kg。然而，它們都遠低于最高水平，這顯示了草果種子的安全性。
圖2. 草果種子的元素概況 (A) 每個群體中可定量元素的平均濃度。(B) 草果種子所有樣本的平均濃度及其變異系數（CV）均高于100%。
鑭系元素被植物根系從土壤中吸收，因此可作為地理標記在食品工業中應用。本研究測量了13種鑭系元素。但是，所有樣品中只有Ce、La和Pr高于LOQ。對于非常接近LOQ的Er和Tm，僅在GS中能定量測到。此外，Yb和Tb在兩個種群中被定量測到，Ho在三個定量中被量化（圖 2A）。因此，單獨的鑭系元素無法作為草果種子的標記物。
2. 元素相關性
對58種元素進行相關性分析，在圖3A和圖3B中，相關系數被分別描繪為p < 0.05，p < 0.001的彩色點。元素Mg、S、B、P和K彼此呈正相關。其中Mg、S、B、P與Ni呈正相關，S、B、P、K與Fe呈負相關，S、B、P與Mo呈負相關，P、K與Sb呈負相關。Mn、Cd、Zn，Tl之間呈正相關，與Mo呈負相關；Mn、Cd與Ga、Ag、Co、Br呈正相關，與Ca呈負相關。同時，觀察到元素Th、Gd、U、Y、Dy、Pr、La、Ce、Nd、Bi、Al、V之間呈正相關，同時與Tm、Ho、Tb、Er也呈正相關。Tm、Ho、Tb、Er、Yb呈正相關。Pr、La、Ce、Nd與Rb呈負相關。值得注意的是，Ga、Ni、Cu，Ge、Pb、Cs，Sr、Ba、Sm元素之間存在顯著的正相關。此外，元素Ga和Ag、Co和Br、Ti和Zr、Si和Fe、Fe和Sb分別彼此正相關。同時，Mo與Na、Co、Br呈負相關。在現階段，雖然很難闡明這些關系，但它們為草果的生理學研究和質量標準的制定提供了重要的依據。
圖3. 58種元素之間的相關性。正相關用紅點表示，負相關用藍點表示，點的權重代表相關系數的值。(A) 相關系數顯示為彩色點，p < 0.05。(B) 相關系數顯示為彩色點，p < 0.001。
3.道地性分析
對58種元素與經度、緯度、海拔高度進行相關性分析。相關系數等于或大于0.5且p值小于0.05作為報告數據的限值。如圖4A所示，經度與B、Mg、P、S、Co呈正相關，與Sr、Fe、Sm呈負相關。緯度與Sr、Fe、Mo呈正相關，與Ba、B、Mg、P、Co呈負相關。海拔與Ba、Sr、Fe、Co、Sm呈正相關，與Mg、P、S、Mo呈負相關。涉及的元素有十種，其中B、Mg、P、Fe、Mo各占一半，為必需元素，Sm為鑭系元素，隨后進行層次聚類分析，采用Pearson距離和ward聚類方法，結果如圖4B所示，很難將其與地理起源聯系起來，表明草果種子中元素的積累不僅受位置的影響，還受土壤、氣候等其他因素的影響。
根據“80%規則”，超過80%樣本中，質量分數已知的32種元素（Li、B、Na、Mg、Al、Si、P、S、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Rb、Sr、Mo、Ag、Cd、Sn、Cs、Ba、La、Ce、W、Pb）用于進一步層次聚類分析如圖5A所示。來自12個種群的樣本被分為三類。第1組包括LC、YJ、TC、JP和YY。第2組包括PB、HK和MG。第3組由DLJ、GS、FG和LS組成。除了JP外，與之前關于草果種子精油與局部生長之間相關性的研究中顯示的模式相似。根據植物區系理論，JP與PB、HK和MG（第2組）一起位于II區。然而，JP在地理上比PB更接近YY（圖 5B），需要在以后的研究中給予更多的關注。然后通過OPLS-DA分析，結果表明組1 vs組2、組1 vs組3、組2 vs組3均有顯著差異，Q2大于0.95 和p值小于5.25×10-23（圖 5C-E）。這意味著這32個元素可用于構建草果種子地理鑒定的指紋識別模型。
圖6. 15種元素的層次聚類分析(HCA)，通過多變量ROC曲線分析過濾。(A) 不同組的HCA。(B) 不同種群的HCA。
LS和TC在地理位置上彼此靠近。在以后的研究中也需要更多的關注。ROC過濾的15種元素包括9種常量必需元素B、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Ni、Mo和6種非必需元素Al、S、V、Co、Sr、Ba。與過濾80%的32種元素相比，缺失了Li、Na、Si、Cr、Cu、Zn、Ge、As、Rb、Ag、Cd、Sn、Cs、La、Ce、W和Pb。但是，在32種元素組合中，有As、Cd、Pb這三種有毒元素和兩種鑭系元素La、Ce。由于有毒元素在食品添加劑和草藥中非常重要，32元素的組合在質量控制中也起著至關重要的作用。
討論
本研究描述了草果種子中的元素分布，所有樣品中69種元素中有11種（Be、Se、Ru、Rh、Pd、Te、Ta、Re、Os、Ir和Pt）低于LOQ。結果表明，常量必需元素的范圍很窄，而非必需元素除Na、S和Cr外均呈現較寬的均值范圍，有毒元素方As、Cd、Hg、Pb的質量分數均在安全范圍內，鑭系元素無法單獨作為草果種子標記物。此外，目前的研究已經顯示出58種元素之間的相關性。盡管很難闡明這些關系，但它們為草果生理學研究和制定草果質量標準提供了重要依據。元素與經度、緯度、海拔的相關結果很難與地理起源聯系起來，草果種子中元素的積累不僅受到地理位置的影響，還受到其他因素的影響。80%規則過濾的32個元素組合和ROC過濾的15個元素組合均可用于建立草果種子地理鑒定的指紋識別模型。同時，32種元素組合由于其中含有As、Cd、Pb三種有毒元素對草果種子的質量控制也起著至關重要的作用。
