新文速遞丨Cell Metab富馬酸與腫瘤
腫瘤微環境中的代謝改變顯著調節免疫敏感性，但其潛在機制尚不清楚。清華大學江鵬課題組、武漢科技大學祝海川課題組和北京大學張新祥課題組合作，于2023年5月在Cell Metabolism期刊發表了題為“Cancer-cell-derived fumarate suppresses the anti-tumor capacity of CD8+T cells in the tumor microenvironment”的文章，報道了腫瘤細胞富馬酸水合酶（fumarate hydratase，FH）缺失導致富馬酸在腫瘤間質液中積累，直接使酪氨酸激酶ZAP70在C96和C102處琥珀酸化，并使其浸潤CD8+T細胞的活性喪失，從而抑制CD8+T細胞的活化和抗腫瘤免疫反應。這些發現證明了富馬酸在控制TCR信號傳導中的作用，并表明富馬酸在腫瘤微環境中的積累是CD8+T細胞抗腫瘤功能的代謝屏障，富馬酸耗盡可能是腫瘤免疫治療的重要策略。原文鏈接：https://www.cell.com/cell metabolism/fulltext/S1550-4131(23)00171-7。
Highlights
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腫瘤特異性FH缺失抑制浸潤CD8+T細胞
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腫瘤細胞產生的富馬酸抑制CD8+T細胞活
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ZAP70被富馬酸修飾后抑制CD8+T細胞活化和抗腫瘤功能
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富馬酸耗盡能增強CAR T細胞的抗腫瘤功效
研究背景
癌癥的特點是連續的基因變化導致不受控制的生長和擴散�；蚪M的不穩定性會產生新抗原，這些抗原可以被捕獲、加工并呈遞給CD8+ T細胞，導致T細胞被激活、識別并靶向癌細胞。ZAP70是一種酪氨酸激酶，在CD8+ T細胞激活的啟動中起關鍵作用。臨床上，腫瘤浸潤淋巴細胞的存在已被證明與患者預后和生存率的改善有關，然而，除了新抗原呈遞缺失或對T細胞產生的細胞因子不敏感等內在因素外，腫瘤還可以通過免疫重編程腫瘤微環境（tumor microenvironment, TME）來抑制T細胞浸潤和活化或誘導功能障礙，從而獲得逃避免疫識別的能力。因此，深入了解TME中的免疫重編程可能為抗腫瘤免疫提供新思路。事實上，已經開發了許多用于治療癌癥的免疫療法，包括免疫檢查點抑制劑阻斷和工程細胞療法。然而，主要由于微環境抑制，這些免疫療法往往免疫功能低下，所涉及的分子機制在很大程度上仍然未知。像癌細胞一樣，包括T淋巴細胞在內的免疫細胞依賴于TME中的某些營養物質來生存、增殖或激活。例如，活化的T細胞使用糖酵解來提供能量，一些氨基酸包括谷氨酰胺、精氨酸和天冬酰胺以及脂質分子如脂肪酸和甾醇，已被證明對T細胞的有效活化和/或擴增是必不可少的。由于代謝需求和T細胞功能都與TME密切相關，因此T細胞的抗腫瘤功能容易受到TME中營養物質變化的影響。盡管代謝需求和變化對T細胞的影響越來越清楚，但關于代謝操縱如何幫助腫瘤細胞逃避T細胞殺傷的報道仍然很少。
研究結果
腫瘤細胞來源的富馬酸抑制TME中CD8+T細胞的激活
腫瘤特異性FH的缺失阻斷CD8+ T細胞中的T細胞抗原受體信號（T cell antigen receptor，TCR）激活，抑制了腫瘤浸潤性CD8+ T細胞的功能。研究推測FH缺失的腫瘤細胞可能在微環境中積累富馬酸從而抑制TME中CD8+ T細胞的激活。作者用[U-13C5]谷氨酰胺處理的FH缺失或正常表達的B16細胞的條件培養基培養CD8+ T細胞，進行了13C代謝流分析（圖1E）。與對照細胞相比，來自FH缺失腫瘤細胞的培養基顯示13C標記的富馬酸增加（圖1F），與用FH正常表達的B16培養基培養的T細胞相比，用FH缺失的B16培養基培養的T細胞中，13C標記的富馬酸水平明顯更高（圖1G）。相比之下，來自[U-13C5]谷氨酰胺的其他TCA循環代謝物的水平在這些CD8+ T細胞中幾乎保持不變（圖1G）。這些結果表明，FH缺失的腫瘤細胞微環境中富馬酸確實積累了，進一步提示腫瘤特異性FH缺失可能通過富馬酸抑制微環境中的CD8+ T細胞。為了驗證這種可能性，作者評估了TCA循環中代謝物對CD8+ T細胞的影響，發現添加富馬酸而不是其他TCA循環代謝物，導致CD8+ T細胞中CD69、CD25和CD44的表達減少，富馬酸或富馬酸酯處理以劑量依賴的方式減弱CD8+ T細胞的活化（圖1H）。
圖1. 腫瘤細胞來源的富馬酸抑制CD8+T細胞功能
C96和C102是富馬酸琥珀化位點，決定了ZAP70的活性
接下來作者研究富馬酸抑制T細胞活化的潛在機制。富馬酸是一種親電試劑，可與蛋白質上的親核半胱氨酸殘基反應，通過Michael加成反應生成S-(2-琥珀酰)半胱氨酸（2SC）。富馬酸這種獨特的反應性意味著它的積累可能會使某些參與信號轉導或代謝的蛋白質發生琥珀酸化。TCR信號傳導的上游激酶ZAP70顯著富集，可能是琥珀酸化的潛在靶點（圖2A）。這一發現與腫瘤細胞中FH的缺失阻礙了CD8+ T細胞中Y493處ZAP70及其下游效應物的磷酸化，而不影響其上游激酶LCK的磷酸化的結果是一致的（圖1C）。接下來，作者通過2SC印跡、體外激酶測定及點突變驗證了富馬酸對ZAP70的琥珀酸化作用，表明C96和C102是富馬酸的琥珀酸化位點，在調節ZAP70激酶活性中起主導作用。
圖2. 確定C96和C102(C96/C102)為決定ZAP70活性的富馬酸琥珀酸化位點
富馬酸使ZAP70琥珀酸化，調節CD8+ T細胞TCR信號，抑制CD8+ T細胞抗腫瘤功能
ZAP70是TCR信號通路中不可缺少的，它的缺乏導致人類和小鼠嚴重的聯合免疫缺陷。接下來，作者進一步研究了富馬酸積累對ZAP70和TCR信號的影響，表明ZAP70是富馬酸琥珀酸化的直接靶點，從而將腫瘤細胞中的富馬酸代謝與CD8+ T細胞中的TCR信號傳導聯系起來，富馬酸介導的ZAP70琥珀酸化會阻礙CD8+ T細胞中的TCR信號傳導。為了評估ZAP70琥珀酸化對TCR信號傳導和T細胞功能的調節作用，作者培養了Zap70C96C102S/C96C102S (Zap70CS/CS)轉基因小鼠。ZAP70CS/CS對富馬酸琥珀酸化具有抗性，但活性降低，表明該突變體可以在功能上減弱富馬酸積累的影響，同時減少TCR信號傳導和T細胞反應。在Zap70CS/CS小鼠中，ZAP70的C96S/C102S突變可有效阻斷TCR信號通路，減少成熟T細胞，從而抑制CD8+ T細胞抗腫瘤能力。細胞和小鼠實驗均表明富馬酸水平的增加抑制了CD8+ T細胞的活化和抗腫瘤活性。
FH表達的增加增強了CAR T細胞的抗腫瘤作用
CAR T療法已被廣泛證明在B細胞惡性腫瘤中具有很好的抗腫瘤作用，然而，很少有關于CAR T細胞在實體腫瘤中介導持續反應的報道。上述發現FH缺失的腫瘤細胞在微環境中通過積累間質富馬酸抑制CD8+ T細胞的激活和抗腫瘤能力，推測T細胞中富馬酸消耗的增加可能會增強T細胞的活性。為了證明這一點，作者首先從4例接受CD19靶向CAR T細胞治療的急性淋巴細胞白血病患者的scRNA-seq數據中分析了FH表達與CAR T細胞功能基因之間的相關性，發現FH的表達水平與CAR T細胞的功能基因表達水平呈強正相關，支持FH確實可能影響CAR T細胞的抗腫瘤活性。體內實驗也得到了類似的結果，來自FH缺失的RAJI細胞的腫瘤抑制了CAR T細胞的細胞溶解活性，降低了小鼠的存活率。
此外，作者還研究了CAR T細胞富馬酸水平的降低是否會增強CAR T細胞的治療效果。FH在抗CD19 CAR T細胞中的過表達強烈降低了細胞富馬酸水平，TCR信號活性和細胞因子產生相應增加，顯著增強了CAR T細胞的體外細胞溶解活性和體內腫瘤殺傷效果。這些數據表明FH是CAR T細胞療效的關鍵調節劑，增加FH表達可能是增強CAR T細胞抗腫瘤能力的有力策略。
討論
腫瘤通過產生抑制性TME來逃避免疫識別和破壞，這種TME排斥T細胞和/或誘導T細胞功能障礙，但TME中的代謝重編程如何促進免疫逃逸仍不清楚。FH突變與腎癌發生密切相關。然而，腫瘤細胞中FH表達或功能失調是否影響TME和腫瘤免疫逃逸尚不明確。這項工作表明腫瘤FH表達的缺失導致間質液富馬酸的積累，并抑制浸潤性CD8+ T細胞的活化和效應功能。此外，各種體內和體外實驗表明，激酶ZAP70是富馬酸的天然傳感器，并提示ZAP70在感知代謝和微環境變化方面可能具有新的功能并可能為了解ZAP70的生物學功能提供新的視角。
在腫瘤免疫治療過程中，功能性CD8+ T細胞浸潤與較好的預后相關。然而，CAR T療法和檢查點阻斷療法僅對一小部分患者有效。CAR T細胞的大部分免疫功能不全是由TME的抑制引起的。然而，涉及的分子調控機制仍有待進一步研究。本研究發現，富馬酸的積累大大降低了CD8+ T細胞和CAR T細胞的抗癌能力，這表明TME中富馬酸的積累可能導致CAR T治療的無反應性。更重要的是，由于富馬酸一方面支持腫瘤細胞增殖，另一方面抑制浸潤性T細胞的激活，通過增加FH表達消耗富馬酸可能是一種非常有吸引力的腫瘤治療策略。
研究的局限性
FH與腎囊腫和某些類型腎細胞癌的發展有關。然而，關于FH在其他類型癌癥中作用的報道非常有限。本研究的部分實驗模型使用了腫瘤免疫學研究中廣泛使用的小鼠B16黑色素瘤細胞系來闡明富馬酸在小鼠腫瘤中的作用。在人類相關性方面，雖然作者根據已發表的單細胞測序數據發現FH表達與幾種人類癌癥的預后相關，但在黑色素瘤患者中相關數據報道較少，需要更多的臨床數據和研究。此外，由于FH在不同組織中的作用可能不同，因此針對FH或富馬酸的腫瘤治療或免疫治療在臨床環境中需要格外謹慎。
延伸閱讀：腫瘤微環境與TCA代謝產物
乳酸：賓夕法尼亞大學M. Celeste Simon團隊2020年6月在Developmental Cell上發表了題為“Cancer Cells Don’t Live Alone: Metabolic Communication within Tumor Microenvironments”的綜述（DOI: 10.1016/j.devcel.2020.06.018），概述了原發和轉移性TME中腫瘤細胞和不同間質成分之間代謝通信的最新進展。在非小細胞肺癌中，曾被認為是代謝廢物的乳酸比葡萄糖更適合作為TCA循環的底物。在這種情況下，乳酸和葡萄糖是并行利用的，因為乳酸可以通過線粒體LDH活性直接進入TCA循環。通過LDHA的乳酸代謝也可能影響胞質氧化還原狀態，并將葡萄糖重定向到戊糖磷酸途徑和己糖胺的生物合成。乳酸作為一種信號分子，可能會改變細胞內的信號通路和/或基因表達，從而影響葡萄糖的攝取和分解代謝。腫瘤腔內的癌細胞相互協作，形成代謝“共生”，乳酸穿梭是一個例子，在缺氧區域的癌細胞通過厭氧糖酵解消耗葡萄糖并釋放乳酸，然后乳酸被鄰近富氧腫瘤區域的癌細胞用作TCA循環的底物。抗血管生成治療引起的急性缺氧促使胰腺神經內分泌和乳腺癌細胞產生過量乳酸，然后被血管附近的癌細胞利用。類似的代謝“共生”在肺癌和結腸癌中也存在。乳酸穿梭可能是單羧酸轉運體（MCTs）差異表達的結果：缺氧的癌細胞表達高水平的MCT4，作為乳酸主要的輸出轉運蛋白，而富氧區域的癌細胞表達MCT1作為乳酸輸入轉運蛋白。目前尚不清楚低氧區域腫瘤來源的乳酸在多大程度上對氧化代謝有貢獻，因為氧氣充足的癌細胞可以很容易地代謝葡萄糖和包括乳酸在內的其他循環營養物質。
丙酮酸和琥珀酸：哈佛醫學院的Marcia C. Haigis課題組和Arlene H. Sharpe課題組于2022年8月在Cell Metabolism雜志上發表了題為“Tumor cells dictate anti-tumor immune responses by altering pyruvate utilization and succinate signaling in CD8+ T cells”的文章（DOI: 10.1016/j.cmet.2022.06.008），發現腫瘤來源的乳酸改變了T細胞的代謝，導致CD8+T細胞中丙酮酸羧化酶（PC）活性降低，抑制了T細胞的細胞毒性。乳酸也改變了丙酮酸進入TCA循環的途徑，從PC重定向到丙酮酸脫氫酶（PDH）。PDH的抑制增加了PC活性和琥珀酸分泌，從而激活琥珀酸分泌和琥珀酸受體1（SUCNR1），增強T細胞的抗腫瘤細胞作用。
草酰乙酸、琥珀酸、富馬酸和2-羥基戊二酸：美國西北大學范伯格醫學院Navdeep S. Chandel團隊2021年10月于Nature Reviews Cancer上發表了題為“Cancer metabolism: looking forward”的綜述（DOI: 10.1038/s41568-021-00378-6），概述了腫瘤代謝領域的最新研究進展。在過去十年，TCA循環再次成為支持腫瘤生長的關鍵合成代謝中心。丙酮酸羧化酶（PC）催化丙酮酸產生TCA循環代謝物草酰乙酸，已被證明是原發和轉移性腫瘤生長所必需的。此外，從草酰乙酸生成的天冬氨酸及其衍生物天冬酰胺都可以限制腫瘤的生長。在特定的腫瘤中，編碼琥珀酸脫氫酶（SDH）、富馬酸水合酶（FH）以及異檸檬酸脫氫酶1或2（IDH1或IDH2）的基因發生功能缺失突變，會造成腫瘤中代謝產物琥珀酸、富馬酸和2-羥基戊二酸（2HG）的濃度增加，這些代謝物是導致不同癌癥的誘因，因此被稱為“腫瘤代謝物”。這三種腫瘤代謝物中任何一種的積累已被證明有助于惡性腫瘤的發展，但僅限于某些組織。原因是這些代謝物與α-酮戊二酸（α-KG）結構相似從而競爭性抑制α-KG依賴的雙加氧酶（α-KGDDs）包括組蛋白去甲基酶、RNA去甲基酶等從而調節表觀遺傳修飾，影響基因表達。
