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客戶文章丨GUT MICROBES嗜粘蛋白阿克曼氏菌與非酒精性脂肪肝炎
下一代益生菌嗜粘蛋白阿克曼氏菌（A.嗜粘蛋白菌）對非酒精性脂肪性肝（NAFLD）具有治療潛力，特別是在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的炎癥階段。然而，A.嗜粘蛋白菌在NASH的預(yù)防作用未知。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王保紅團(tuán)隊(duì)于2023年在Gut Microbes期刊上發(fā)表“Akkermansia muciniphila inhibits nonalcoholic steatohepatitis by orchestrating TLR2-activated γδT17 cell and macrophage polarization” 的研究論文，補(bǔ)充A.嗜粘蛋白菌可預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠的肝臟炎癥，其特征在于肝臟促炎性巨噬細(xì)胞（M1）和γδT、γδT17細(xì)胞減少。此外，A.嗜粘蛋白菌抑制NASH小鼠腸屏障破壞并相應(yīng)下調(diào)肝臟Toll樣受體2（TLR2）表達(dá)。原文鏈接：https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2221485，我公司參與了該研究中短鏈脂肪酸酸的定量檢測工作。
1、A.嗜粘蛋白菌抑制HFD誘導(dǎo)的小鼠NASH
基線血清生化特征數(shù)據(jù)，包括ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C和GLU，顯示三組小鼠之間無顯著差異，表明各組之間基礎(chǔ)狀況正常化。與喂食對照飼料的小鼠相比，高脂飲食（HFD）四周后小鼠體重明顯增加，但攝食量減少，在實(shí)驗(yàn)的第16周，A.嗜粘蛋白菌明顯降低HFD組小鼠的體重，但對攝食量沒有影響。此外，第8周的生化檢測結(jié)果表明，HFD可引起血清GLU和TC水平升高，而A.嗜粘蛋白菌沒有改善。第11周，A.嗜粘蛋白菌治療顯著改善了對葡萄糖給藥的反應(yīng)。第12周，A.嗜粘蛋白菌改善了小鼠血清GLU的水平，但沒有提高TC的水平。第18周，模型小鼠的血糖和總膽固醇均被A.嗜粘蛋白菌逆轉(zhuǎn)。第20周，與對照小鼠相比，在模型小鼠中發(fā)現(xiàn)ALT和AST水平增加，肝臟脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤增加，以及NAFLD活性評分（NAS）升高，在A.嗜粘蛋白菌治療處理后明顯改善。
2、A.嗜粘蛋白菌控制NASH模型小鼠γδT聚集和巨噬細(xì)胞極化
進(jìn)一步研究肝臟免疫反應(yīng)，在NASH小鼠中分離肝臟單核細(xì)胞并在治療20周后進(jìn)行FACS。肝臟γδT細(xì)胞，產(chǎn)生IL-17的γδT細(xì)胞(γδT17細(xì)胞)和促炎性M1巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+Ly6C+CD206−)，以及CD3+t細(xì)胞和炎性NKT細(xì)胞在HFD誘導(dǎo)的NASH小鼠中富集。此外，與對照組小鼠相比，抗炎M2巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+Ly6C−CD206+)在NASH小鼠的肝臟中減少。重要的是，A.粘蛋白菌給藥明顯抑制γδT細(xì)胞、γδT17細(xì)胞和M1細(xì)胞的累積，但對其他肝臟免疫細(xì)胞無明顯影響。此外，肝臟RNA-seq分析表明，HFD和HFD+AKK組小鼠的巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記發(fā)生了變化。與對照組相比，HFD小鼠肝臟中M1標(biāo)記物（Tnf、Ccr 2、Cxcl 9和Cxcl 10）的基因表達(dá)增加，M2標(biāo)記物（Arg 1）的基因表達(dá)減少，這部分被A.嗜粘蛋白體利用。qRT-PCR分析顯示，與HFD組相比，A.嗜粘蛋白菌上調(diào)M2標(biāo)志物Retnla的表達(dá)。
3、A.嗜粘蛋白菌下調(diào)NASH模型小鼠肝臟TLR2表達(dá)
為研究細(xì)菌致病成分或免疫代謝物對肝臟免疫反應(yīng)的影響，進(jìn)行了RNA測序（RNA-seq）分析。HFD小鼠肝臟炎癥標(biāo)記物（如Tnf、Ccl2、Ccl3、Ccl7和Hsp90）的表達(dá)高于對照組，這一現(xiàn)象A.粘蛋白菌被部分逆轉(zhuǎn)。qRT PCR分析證實(shí)A.粘蛋白菌下調(diào)HFD誘導(dǎo)的肝臟中Tnf表達(dá)的富集。進(jìn)一步分析了識別細(xì)菌致病成分（如TLRs和NODs）或免疫代謝物（如AhR、FRAR和FXR）的受體的肝臟基因表達(dá)。HFD飼養(yǎng)增加了肝臟TLR1、TLR2、TLR3和TLR7的基因表達(dá)，降低了CD1d和FXR。A.粘蛋白菌僅在HFD小鼠的肝臟中逆轉(zhuǎn)了TLR1/2的基因表達(dá)。因此，假設(shè)A.粘蛋白菌NASH的發(fā)生可能是由于微生物來源的TLR2信號與肝臟巨噬細(xì)胞或γδT細(xì)胞之間的相互干擾。
4、A.嗜粘蛋白菌增加NASH小鼠腸道SCFA濃度和色氨酸代謝
先前的研究表明，A.嗜粘蛋白菌產(chǎn)生SCFAs（例如丙酸鹽和乙酸鹽），參與維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。測定了盲腸內(nèi)容物中的短鏈脂肪酸濃度，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸和戊酸。與對照組相比，HFD小鼠中甲酸、乙酸和丙酸的濃度顯著降低。補(bǔ)充A.嗜粘蛋白菌誘導(dǎo)了丙酸、2-甲基丁酸、異戊酸和戊酸的富集，并導(dǎo)致HFD小鼠中甲酸、乙酸和丁酸增加的趨勢。總SCFA濃度在HFD小鼠中降低，并通過補(bǔ)充逆轉(zhuǎn)。相應(yīng)地，HFD明顯下調(diào)了SCFA受體的基因表達(dá)FFAR2（GPR43），以及A.粘蛋白菌將FFAR2表達(dá)恢復(fù)到對照組小鼠的水平。此外， HFD上調(diào)了DPPIV（使GLP-1失活的酶）的結(jié)腸基因表達(dá)，并降低了血清GLP-1水平，這些被A.嗜粘蛋白菌逆轉(zhuǎn)。
除了短鏈脂肪酸，腸道微生物群通過代謝物（包括膽汁酸和色氨酸代謝物）的調(diào)節(jié)作用在腸道屏障保護(hù)中發(fā)揮作用。在腸道中，色氨酸可以通過三種主要途徑被微生物群直接或間接代謝：吲哚途徑、犬尿氨酸途徑和血清素途徑。基于全譜代謝組分析，發(fā)現(xiàn)HFD治療減少了腸道中的大多數(shù)色氨酸代謝物，包括吲哚、褪黑激素、吲哚3-乳酸、3-羥基犬尿氨酸、吲哚3-乙酸、L-犬尿氨酸和血清素。連續(xù)給藥A.粘蛋白菌部分逆轉(zhuǎn)色氨酸代謝物的水平，特別是3-羥基犬尿氨酸和5-羥基犬尿氨酸。值得注意的是，A.嗜粘蛋白菌處理上調(diào)了HFD小鼠腸道中介導(dǎo)色氨酸降解為犬尿氨酸的酶（Ido 1、Ido 2、Tdo 2、Kynu和Kmo）的基因表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了HFD小鼠腸道中Ahr、Cyp 1b 1和IL-22的基因表達(dá)。也就是說，A.嗜粘蛋白菌還調(diào)節(jié)NASH小鼠腸道中色氨酸向犬尿氨酸途徑的代謝。
5、TLR2激動(dòng)劑可促進(jìn)肝臟γδT細(xì)胞聚集，消除A.嗜粘蛋白菌對小鼠NASH的保護(hù)作用
進(jìn)一步研究了微生物來源的TLR2與肝臟巨噬細(xì)胞或γδT細(xì)胞之間通過TLR2激動(dòng)劑給藥的潛在相互作用。值得注意的是，單獨(dú)的脂磷壁酸（LTA）富集了飼喂正常食物飲食的小鼠中肝臟γδT細(xì)胞、TLR 2 + γδT細(xì)胞和γδT17細(xì)胞的比例，但不直接影響M1/M2細(xì)胞。LTA改變了HFD+AKK組小鼠的ALT和AST水平，使其接近HFD組小鼠的水平，但與HFD+AKK組小鼠相比，LTA對攝食量、體重、TC和TG沒有影響。單獨(dú)的LTA治療藥物沒有改變對照組小鼠中ALT、AST、TC和TG的水平。A.嗜粘蛋白菌通過下調(diào)腸源性TLR2信號減少肝臟炎性γδT細(xì)胞。
6、γδT細(xì)胞可能通過IL-17信號與巨噬細(xì)胞相互作用
在NASH小鼠模型中，A.嗜粘蛋白菌通過調(diào)節(jié)γδT積聚和巨噬細(xì)胞極化來抑制肝臟炎癥。分析測量了肝臟γδT細(xì)胞和M1細(xì)胞的水平，發(fā)現(xiàn)肝臟γδT細(xì)胞與NASH小鼠中的M1細(xì)胞正相關(guān)，表明γδT細(xì)胞在巨噬細(xì)胞極化中的作用。為了進(jìn)一步研究γδT細(xì)胞（一種主要類型的IL−17產(chǎn)生細(xì)胞）是否對巨噬細(xì)胞極化有任何調(diào)節(jié)作用，在體外用重組IL− 17 A刺激巨噬細(xì)胞。用10 ng/ mL或100 ng/mL重組IL-17 A刺激骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM）細(xì)胞。IL-17顯著促進(jìn)BMDM的M1標(biāo)記物（Nos 2和IL-6）的基因表達(dá)，并輕微影響M2標(biāo)記物（Arg-1）的基因表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL−17和巨噬細(xì)胞之間的相互作用，IL−17顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞Ana−1細(xì)胞M1標(biāo)志物（Nos 2和IL −6）的基因表達(dá)，并持續(xù)抑制M2標(biāo)志物（Arg−1和IL−10）的基因表達(dá)。結(jié)果表明，IL-17可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化成促炎性M1細(xì)胞，活化的γδT細(xì)胞可以通過IL-17促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化，提示兩種肝臟先天免疫細(xì)胞之間存在直接聯(lián)系。
7、結(jié)論
確定了兩個(gè)關(guān)鍵的肝臟先天免疫細(xì)胞（γδT和巨噬細(xì)胞），它們受A.嗜粘蛋白菌調(diào)節(jié)。在NASH小鼠的肝臟中，A.嗜粘蛋白菌保護(hù)腸屏障并進(jìn)一步下調(diào)微生物來源的TLR 2信號傳導(dǎo)。此外，通過給予TLR 2前藥，證明了A.嗜粘蛋白菌通過下調(diào)肝TLR 2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低γδT17細(xì)胞水平。γδT細(xì)胞通過IL−17促進(jìn)巨噬細(xì)胞向促炎性M1細(xì)胞極化。總體而言，A.嗜粘蛋白菌通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白和微生物源性代謝產(chǎn)物增強(qiáng)腸屏障，通過下調(diào)TLR 2減少肝γδT17細(xì)胞，這進(jìn)一步通過IL-17調(diào)節(jié)肝巨噬細(xì)胞極化，最終抑制非酒精性脂肪性肝炎。
