客戶文章丨GUT MICROBES嗜粘蛋白阿克曼氏菌與非酒精性脂肪肝炎
下一代益生菌嗜粘蛋白阿克曼氏菌（A.嗜粘蛋白菌）對非酒精性脂肪性肝（NAFLD）具有治療潛力，特別是在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的炎癥階段。然而，A.嗜粘蛋白菌在NASH的預防作用未知。浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室王保紅團隊于2023年在Gut Microbes期刊上發表“Akkermansia muciniphila inhibits nonalcoholic steatohepatitis by orchestrating TLR2-activated γδT17 cell and macrophage polarization” 的研究論文，補充A.嗜粘蛋白菌可預防高脂飲食誘導的NASH小鼠的肝臟炎癥，其特征在于肝臟促炎性巨噬細胞（M1）和γδT、γδT17細胞減少。此外，A.嗜粘蛋白菌抑制NASH小鼠腸屏障破壞并相應下調肝臟Toll樣受體2（TLR2）表達。原文鏈接：https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2221485，我公司參與了該研究中短鏈脂肪酸酸的定量檢測工作。
1、A.嗜粘蛋白菌抑制HFD誘導的小鼠NASH
基線血清生化特征數據，包括ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C和GLU，顯示三組小鼠之間無顯著差異，表明各組之間基礎狀況正常化。與喂食對照飼料的小鼠相比，高脂飲食（HFD）四周后小鼠體重明顯增加，但攝食量減少，在實驗的第16周，A.嗜粘蛋白菌明顯降低HFD組小鼠的體重，但對攝食量沒有影響。此外，第8周的生化檢測結果表明，HFD可引起血清GLU和TC水平升高，而A.嗜粘蛋白菌沒有改善。第11周，A.嗜粘蛋白菌治療顯著改善了對葡萄糖給藥的反應。第12周，A.嗜粘蛋白菌改善了小鼠血清GLU的水平，但沒有提高TC的水平。第18周，模型小鼠的血糖和總膽固醇均被A.嗜粘蛋白菌逆轉。第20周，與對照小鼠相比，在模型小鼠中發現ALT和AST水平增加，肝臟脂肪變性和炎性細胞浸潤增加，以及NAFLD活性評分（NAS）升高，在A.嗜粘蛋白菌治療處理后明顯改善。
2、A.嗜粘蛋白菌控制NASH模型小鼠γδT聚集和巨噬細胞極化
進一步研究肝臟免疫反應，在NASH小鼠中分離肝臟單核細胞并在治療20周后進行FACS。肝臟γδT細胞，產生IL-17的γδT細胞(γδT17細胞)和促炎性M1巨噬細胞(CD11b+F4/80+Ly6C+CD206−)，以及CD3+t細胞和炎性NKT細胞在HFD誘導的NASH小鼠中富集。此外，與對照組小鼠相比，抗炎M2巨噬細胞(CD11b+F4/80+Ly6C−CD206+)在NASH小鼠的肝臟中減少。重要的是，A.粘蛋白菌給藥明顯抑制γδT細胞、γδT17細胞和M1細胞的累積，但對其他肝臟免疫細胞無明顯影響。此外，肝臟RNA-seq分析表明，HFD和HFD+AKK組小鼠的巨噬細胞極化標記發生了變化。與對照組相比，HFD小鼠肝臟中M1標記物（Tnf、Ccr 2、Cxcl 9和Cxcl 10）的基因表達增加，M2標記物（Arg 1）的基因表達減少，這部分被A.嗜粘蛋白體利用。qRT-PCR分析顯示，與HFD組相比，A.嗜粘蛋白菌上調M2標志物Retnla的表達。
3、A.嗜粘蛋白菌下調NASH模型小鼠肝臟TLR2表達
為研究細菌致病成分或免疫代謝物對肝臟免疫反應的影響，進行了RNA測序（RNA-seq）分析。HFD小鼠肝臟炎癥標記物（如Tnf、Ccl2、Ccl3、Ccl7和Hsp90）的表達高于對照組，這一現象A.粘蛋白菌被部分逆轉。qRT PCR分析證實A.粘蛋白菌下調HFD誘導的肝臟中Tnf表達的富集。進一步分析了識別細菌致病成分（如TLRs和NODs）或免疫代謝物（如AhR、FRAR和FXR）的受體的肝臟基因表達。HFD飼養增加了肝臟TLR1、TLR2、TLR3和TLR7的基因表達，降低了CD1d和FXR。A.粘蛋白菌僅在HFD小鼠的肝臟中逆轉了TLR1/2的基因表達。因此，假設A.粘蛋白菌NASH的發生可能是由于微生物來源的TLR2信號與肝臟巨噬細胞或γδT細胞之間的相互干擾。
4、A.嗜粘蛋白菌增加NASH小鼠腸道SCFA濃度和色氨酸代謝
先前的研究表明，A.嗜粘蛋白菌產生SCFAs（例如丙酸鹽和乙酸鹽），參與維持腸道免疫穩態。測定了盲腸內容物中的短鏈脂肪酸濃度，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸和戊酸。與對照組相比，HFD小鼠中甲酸、乙酸和丙酸的濃度顯著降低。補充A.嗜粘蛋白菌誘導了丙酸、2-甲基丁酸、異戊酸和戊酸的富集，并導致HFD小鼠中甲酸、乙酸和丁酸增加的趨勢。總SCFA濃度在HFD小鼠中降低，并通過補充逆轉。相應地，HFD明顯下調了SCFA受體的基因表達FFAR2（GPR43），以及A.粘蛋白菌將FFAR2表達恢復到對照組小鼠的水平。此外， HFD上調了DPPIV（使GLP-1失活的酶）的結腸基因表達，并降低了血清GLP-1水平，這些被A.嗜粘蛋白菌逆轉。
除了短鏈脂肪酸，腸道微生物群通過代謝物（包括膽汁酸和色氨酸代謝物）的調節作用在腸道屏障保護中發揮作用。在腸道中，色氨酸可以通過三種主要途徑被微生物群直接或間接代謝：吲哚途徑、犬尿氨酸途徑和血清素途徑。基于全譜代謝組分析，發現HFD治療減少了腸道中的大多數色氨酸代謝物，包括吲哚、褪黑激素、吲哚3-乳酸、3-羥基犬尿氨酸、吲哚3-乙酸、L-犬尿氨酸和血清素。連續給藥A.粘蛋白菌部分逆轉色氨酸代謝物的水平，特別是3-羥基犬尿氨酸和5-羥基犬尿氨酸。值得注意的是，A.嗜粘蛋白菌處理上調了HFD小鼠腸道中介導色氨酸降解為犬尿氨酸的酶（Ido 1、Ido 2、Tdo 2、Kynu和Kmo）的基因表達，逆轉了HFD小鼠腸道中Ahr、Cyp 1b 1和IL-22的基因表達。也就是說，A.嗜粘蛋白菌還調節NASH小鼠腸道中色氨酸向犬尿氨酸途徑的代謝。
5、TLR2激動劑可促進肝臟γδT細胞聚集，消除A.嗜粘蛋白菌對小鼠NASH的保護作用
進一步研究了微生物來源的TLR2與肝臟巨噬細胞或γδT細胞之間通過TLR2激動劑給藥的潛在相互作用。值得注意的是，單獨的脂磷壁酸（LTA）富集了飼喂正常食物飲食的小鼠中肝臟γδT細胞、TLR 2 + γδT細胞和γδT17細胞的比例，但不直接影響M1/M2細胞。LTA改變了HFD+AKK組小鼠的ALT和AST水平，使其接近HFD組小鼠的水平，但與HFD+AKK組小鼠相比，LTA對攝食量、體重、TC和TG沒有影響。單獨的LTA治療藥物沒有改變對照組小鼠中ALT、AST、TC和TG的水平。A.嗜粘蛋白菌通過下調腸源性TLR2信號減少肝臟炎性γδT細胞。
6、γδT細胞可能通過IL-17信號與巨噬細胞相互作用
在NASH小鼠模型中，A.嗜粘蛋白菌通過調節γδT積聚和巨噬細胞極化來抑制肝臟炎癥。分析測量了肝臟γδT細胞和M1細胞的水平，發現肝臟γδT細胞與NASH小鼠中的M1細胞正相關，表明γδT細胞在巨噬細胞極化中的作用。為了進一步研究γδT細胞（一種主要類型的IL−17產生細胞）是否對巨噬細胞極化有任何調節作用，在體外用重組IL− 17 A刺激巨噬細胞。用10 ng/ mL或100 ng/mL重組IL-17 A刺激骨髓源性巨噬細胞（BMDM）細胞。IL-17顯著促進BMDM的M1標記物（Nos 2和IL-6）的基因表達，并輕微影響M2標記物（Arg-1）的基因表達。為了進一步驗證IL−17和巨噬細胞之間的相互作用，IL−17顯著促進巨噬細胞Ana−1細胞M1標志物（Nos 2和IL −6）的基因表達，并持續抑制M2標志物（Arg−1和IL−10）的基因表達。結果表明，IL-17可以促進巨噬細胞極化成促炎性M1細胞，活化的γδT細胞可以通過IL-17促進巨噬細胞極化，提示兩種肝臟先天免疫細胞之間存在直接聯系。
7、結論
確定了兩個關鍵的肝臟先天免疫細胞（γδT和巨噬細胞），它們受A.嗜粘蛋白菌調節。在NASH小鼠的肝臟中，A.嗜粘蛋白菌保護腸屏障并進一步下調微生物來源的TLR 2信號傳導。此外，通過給予TLR 2前藥，證明了A.嗜粘蛋白菌通過下調肝TLR 2信號轉導降低γδT17細胞水平。γδT細胞通過IL−17促進巨噬細胞向促炎性M1細胞極化。總體而言，A.嗜粘蛋白菌通過調節緊密連接蛋白和微生物源性代謝產物增強腸屏障，通過下調TLR 2減少肝γδT17細胞，這進一步通過IL-17調節肝巨噬細胞極化，最終抑制非酒精性脂肪性肝炎。
