新文速遞丨Biophys Rep 50種脂肪酸的快速定量方法
脂肪酸（FAs）是所有具有多種生理功能的生物體的重要營養素，定量分析大量人群隊列中少量生物樣品的脂肪酸組成（脂肪酸組）對于理解這些功能至關重要。脂肪酸通常可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，包括單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。多不飽和脂肪酸（包括n3和n6）是哺乳動物以及人類的必需脂肪酸，在生物樣品中，這些脂肪酸以游離脂肪酸（FFAs）和酯化脂肪酸的形式存在，例如磷脂、鞘脂（SPs）、甘油酯、膽固醇酯（CEs）、羥基脂肪酸的脂肪酸酯（FAHFAs）和酰基肉堿。FAs及其代謝物的生物學功能多種多樣，包括細胞膜穩態、能量生成、轉錄因子活性的調節和信號傳導。各種形式的FAs被進一步認為是營養狀況、心臟代謝和神經退行性疾病以及癌癥的指標。例如，一組由八種脂肪酸組成的生物標志物可以有效地指示細胞活力，并表征胺碘酮的肝毒性。FAs的生物學功能不斷出現，但遠未完全了解，因此在少量樣品中定量脂肪酸組成的高通量方法仍然是必不可少的，特別是對于大型隊列研究。
FAs的定量通常使用GC-FID/MS，具有高靈敏度、分離位置異構體和順反異構體的能力、出色的穩定性以及脂肪酸甲酯（FAMEs）數據庫的可用性。通過測量由堿或酸催化的酯交換反應產生的脂肪酸甲酯來實現。前者包括氫氧化鉀（KOH-MeOH）和甲醇鈉（NaOCH3），后者包括三氟化硼（BF3-MeOH）、甲醇鹽酸（HCl-MeOH）、甲醇硫酸（H2SO4-MeOH）和甲醇乙酰氯（CH3COCl-MeOH）。然而，堿基對FFAs和SMs的甲基化無效，而BF3-MeOH不穩定且有毒，HCl-MeOH和H2SO4-MeOH制備不方便，高溫下可形成副產物，CH3COCl-MeOH是最合適的方法。
復旦大學人類表型組研究院分子表型代謝組平臺唐惠儒教授團隊開發了一種使用CH3COCl-MeOH的酯交換方法并確保所有重要形式的脂質中的FAs完全甲基化，然后開發了一種快速GC-FID/MS方法，通過8分鐘的數據采集同時定量多種生物基質中的所有FAs。進一步建立了FAMEs的無加性保留指數（NARI）來糾正批次效應，并建立了分析物的定量結構-保留關系（QSRR）模型來預測沒有標準的FAMEs的保留率。原文鏈接：https://doi.org/10.52601/bpr.2023.230042。我公司參與了該研究中脂肪酸檢測方法的部分開發工作。
研究內容
采用Agilent 9000氣相色譜（GC）系統，火焰電離檢測器（FID）和Agilent 5977B電子電離質譜儀（Agilent Technologies, USA）進行定量。采用人血漿樣品，系統優化了CH3COCl濃度、反應時間和溫度等參數。對方法的靈敏度、線性、精密度、準確度和穩定性進行驗證。利用45個FA標準的FAMES的實驗tR值，針對其碳鏈長度（CL）、雙鍵數（DB）和DB位置（DBP）等結構特征，構建多變量正交多項式回歸模型（MOMR）。采用r -軟件的LM函數進行評價，并進行5次交叉驗證，得到預測誤差最小的模型。在無任何外源性添加劑的情況下，選用內源FAs中FAMES的實驗tR值建立保留指數，以校正不同實驗條件（如溫度梯度、流速和批間變化）導致的tR變化。
研究結果
1.脂肪酸的高效酯交換及GC-FID/MS定量分析
將所有脂質中的FAs有效轉化為FAMEs是使用GC-FID/MS對其進行高覆蓋率定量的先決條件。MeOH-CH3COCl是一種溫和、安全的酯交換試劑。優化到最佳反應參數：乙酰氯濃度為CH3COCl 12.5%, 衍生化反應條件為73°C, 時長3 h和甲醇/己烷比（V/V）為6:1，可使95%的脂質甲基化（圖1A），不同碳鏈長度的單鍵和雙鍵不飽和脂肪酸的異構化副產物均小于2%（圖1B）。
圖1 A不同脂類的轉甲基化效率（12.5% CH3COCl, 73℃，3 h）。包括膽固醇酯（CE）、甘油三酯（TG）、二甘油三酯（DG）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、磷脂酰膽堿（PC）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、游離脂肪酸（FFA）、羥基脂肪酸脂肪酸酯（FAHFA）、酰基肉堿（ACar）、鞘磷脂（SM）和神經酰胺（Cer）。B一些代表性不飽和脂肪酸的異構化與溫度和CH3COCl濃度的關系。C 10 μL人體體液（尿液和血漿）和10 mg其他生物基質（H1299細胞、小鼠盲腸內容物和兔肝組織）中脂肪酸的濃度。
全面優化的GC-FID/MS參數在8分鐘內完成了FAs的同時定量，顯示了異構體的良好分離，如C18:3n6-C18:3n3和C18:2n6t-C18:2n6c（圖2）。此外，該方法具有良好的線性（R2＞0.994），柱上的檢出限（信噪比~3）和LOQ（信噪比~10）分別低于20和40 fmol（低至0.5和2 fmol）。對于三種濃度水平，日內和日間CV值均低于20%（95%的分析物低于15%），回收率為80%-120%，在自動進樣器（20°C）中以及儲存溫度為4°C和-80°C條件下穩定性良好（CV＜15%）。
圖2 45個甲基化FAs的GC-FID/MS分析的總離子色譜圖
2.適用多種典型生物基質中脂肪酸定量分析
這種方法適用于多種典型生物基質（包括人類尿液、血漿、細胞、動物腸道內容物和肝組織樣品）中脂肪酸的定量分析。結果顯示這些生物樣品的FA組成和分子表型存在顯著差異（圖1C），人血漿中FAs的組成與報道大致一致，成功地定量了健康人血漿中的30種FAs，包括一些低水平的FAs。
3.FAMEs的定量結構-保留關系和無添加劑保留指數
分析物的定量結構-保留關系（QSRR）對于預測其保留時間至關重要。實驗tR結果清楚地顯示了FAMEs的碳鏈長度（CL）、雙鍵數（DB）和位置（DBP）的依賴性。利用MOMR和最佳子集選擇方法，利用45個代表性FAMEs的數據建立了tR作為CL(c)， DB(d)和DBP(p)函數的經驗數學模型，tR=- 6.11E−4c3+2.56E−3c2p+4.58E−2c2+8.21E−3cd2-0.18d2-0.10cp- 0.78c+0.22d+0.97p+5.85。五重交叉驗證表明，模型信度相關性好（R2, 0.9871），殘差標準誤差較小（0.16 min）。這45個FAMEs的模型計算值（tRC）與實驗保留時間（tRE）具有良好的相關性（R2 ~0.9899） （圖3A）。對于未納入模型構建但在生物樣品中檢測到的5種測試分析物，其預測tR值與實測值一致，ΔtR< 0.38 min（圖3B）。
圖3 （A）定量結構-保留關系得出的實驗值（tRE）和（B）計算值（tRC）的相關性和六種測試分析物的預測精度
此外，為了糾正由于不同溫度梯度、流速和采集批次而導致的tR漂移，開發一種無添加劑保留指數（NARI），使用樣品中內源性的飽和脂肪酸甲酯（SFAMEs）代替傳統的RI中添加的烷烴。在本研究中，在同一批分析的多種不同基質（混合FAME標準品、人尿、血漿、H1299C細胞、小鼠糞便和兔肝組織）中，所有分析物的保留時間都有微小的變化（ΔtR < 0.04 min）。相比之下，不同溫度梯度、流速和批次之間的保留時間差異要大得多，從三組SFAMEs得到三種不同的NARI方案都顯示出對不同溫度梯度、流量和批次的tR變化的修正能力。
研究結論
開發的一種8分鐘的GC-FID/MS方法，可同時定量生物樣品中的FA成分，具有飛摩爾級的靈敏度、良好的準確度、精密度、穩定性以及對生物流體、細胞、腸內容物和組織的適用性。對這些生物樣品的分子表型進行了定量表征，顯示哺乳動物細胞、肝臟和血漿樣品中多種奇碳脂肪酸的水平異常高，與飲食和腸道微生物有關。建立了內源性分析物的無添加劑保留指數，以便比較不同批次的tR數據，進一步建立了具有可變鏈長、雙鍵數和位置的FAMEs的定量結構-保留關系，可預測沒有標準品情況下FAMEs的tR值。
不同種類樣品中測到的FA數量
