干貨分享丨全血/血漿/血清/紅細胞中脂肪酸檢測
在科研工作中，你是不是也曾被這個問題困擾？
在調研文獻的時候，明明都是測脂肪酸，有的文獻是測全血，有的是血漿，有的是血清，甚至還有測紅細胞的？到底哪種樣品類型最合適？
好不容易確定了這個問題，檢測方又拋出了一個新問題，是要測總脂肪酸？還是測游離脂肪酸？大腦CPU都要被燒干了，這兩者又有什么區別？
接下來，我們用最具學術精神的回答，溯源每個問題的本真。
各種類型血樣的權威定義？
全血（Whole Blood）：采用特定的方法將符合要求的獻血者體內一定量外周靜脈血采集至塑料血袋內，與一定量的保養液混合而成的血液制劑（GB 18469-2012、WS/T 203-2020）。全血制劑的成分與體內循環血液成分基本一致，采集后隨著保存期的延長，全血中血小板及不穩定凝血因子逐漸失去生物學活性。目前臨床應用較少，主要用于制備成分血（《全血和成分血使用標準釋義》）。上面是獻血相關標準中的嚴格定義，在臨床和科研實踐中，有用抗凝采血管收集外周血的，也有用濾紙片收集末梢血的，也有用毛細管收集動物眼眶后靜脈血的。
血漿（Plasma）：血漿是血液的非細胞成分，含有水分、無機物、糖類、脂類和蛋白質等。血漿中的蛋白質主要包含白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子及纖溶蛋白等（《全血和成分血使用標準釋義》）。
血清（Serum）：血凝塊會發生收縮析出的淡黃色液體，稱為血清（《生理學》）。血清與血漿的主要區別是前者不含纖維蛋白原（WS/T 225-2024）。
紅細胞（Red Blood Cell）：紅細胞是血液中的一種無核細胞，正常紅細胞呈雙凹面盤狀。紅細胞是運送氧氣最主要的載體（《全血和成分血使用標準釋義》）。血清和血漿中均不含有紅細胞。
如何制備這些血樣？
全血：全血標本的采集同血漿標本。全血需盡快分離，未分離的全血在常溫放置會影響其穩定，穩定時間不超過2 小時（WS/T 225-2024）。注意，全血樣本不需要離心，按照臨床標準采集的全血樣本中含有抗凝劑。
血漿：當檢測標本類型為血漿時，應使用含有抗凝劑的采血管，在標本采集完成后應立即進行充分混勻，以避免纖維蛋白絲、微小凝塊及血凝塊的形成，同時應避免混勻力度過大造成的血細胞損傷/溶血、血小板激活或凝血的發生。抗凝標本可以立即離心。實驗室應針對所用離心機的類型咨詢采血設備制造商關于離心速度和時間的建議。RCF是比RPM更有意義的指標，實驗室宜根據RCF規定離心的要求，并核查在規定離心條件下采血管凝膠屏障的完整性（WS/T 225-2024）。在此之前舊標準建議RCF為1000g～1200g，離心時間為5～10min（WS/T 225-2002）。注意，檢測同一項目的血漿，需要使用相同的抗凝劑。
圖1 全血和血漿樣本的制備和區別
血清：標本在離心前應保證血液凝固充分，不可手工剝離凝塊。通常在室溫下放置30分鐘至60分鐘可完全凝固，37 ℃水浴可加速血液凝固，冷藏會延遲血液凝固，使用含有促凝劑采血管可明顯縮短血液凝固的時間。如果患者接受抗凝治療，則血液凝固時間會延長（WS/T 225-2024）。關于離心的部分同血漿。注意，血清樣本一定沒有抗凝劑。
圖2 血清和血漿樣本的區別
紅細胞：紅細胞成分主要來源是全血采集后經離心分離，也可通過血細胞分離機采集制備。常見紅細胞成分包括懸浮紅細胞、濃縮紅細胞、洗滌紅細胞和冰凍解凍去甘油紅細胞等。紅細胞成分也可通過去白細胞處理為去白細胞紅細胞，通過輻照處理成輻照紅細胞（《全血和成分血使用標準釋義》）。不同紅細胞成分的制備可以參考GB 18469-2012。注意，凍存后的全血樣本無法再提取紅細胞，因為全血解凍后易發生嚴重溶血（紅細胞凍融過程細胞膜漲破）。存儲的紅細胞樣品要盡可能去除水。
紅細胞壓積（Hematocrit，HCT）：紅細胞比容，也可簡稱為PCV（packed cell volume，PCV），是指在一定條件下，經離心沉淀壓緊的紅細胞占全血的容積比，是一種間接反映紅細胞數量、大小及體積的表示方法《全血和成分血使用標準釋義》。簡單來說，將少量抗凝血加入毛細管中，高速離心后，測試管各界面讀數來計算比容（WS/T 342-2011）。注意，需要使用新鮮的全血檢測紅細胞壓積，凍存后的全血會發生溶血。
干血斑（Dried Blood Spot，DBS）：使用尖頭器械穿刺或切開皮膚以獲取毛細血管血液（通常稱為末梢血），包含來自小動脈、小靜脈、間質和細胞內液體的未知比例的血液混合物。皮膚穿刺采血常用于兒科患者少量血液標本的采集，還可用于濾紙收集、床旁檢驗等標本的采集。手指是成人和年齡較大兒童常用皮膚穿刺部位，對于新生兒和嬰兒宜進行足跟采血制作干血斑（WS/T 225-2024）。也可以在樣本運輸、保存困難的情況下也可用于成人樣本的采集。將采集的各種血液樣品制備成濾紙干血斑，最常用的是用抗凝全血、外周全血和血漿制備濾紙干血斑。用移液器吸取100μl抗凝全血（或血漿）樣品，對準濾紙印圈的中心處，將樣品滴在濾紙上，或將穿刺后自皮膚傷口流出的外周全血直接滴加在濾紙印圈的中心處。在室溫下自然干燥至少4h（潮濕氣候下至少干燥24h），血斑充分干燥后，將其放入密封袋中（《艾滋病性病防治》）。注意，干血斑可能是末梢血，也可能是全血，甚至可能是血漿。但是檢測同一項目的樣品，需要保持一致。
血樣的保存條件和時間？
在文獻檢索的過程，我們發現一篇2016年的“重量級”的綜述（DOI: 10.1016/j.plefa.2015.12.003），基本上對各種類型的樣本的保存溫度、時間、是否加保護劑等條件進行了全方位的排列組合（Table 1~4）。感興趣的同學可以下載全文對照一下自己的樣本的收集和保存過程。
對于血清和血漿樣本，室溫下不要暴露超過6個小時，4度可保存6天，-20度可保存1~3年，-80度保存時間可以長達10年。
紅細胞沒有跨度這么長時間的研究，其中最長的是-80度保存4年，-20度下可以保存90天，但是與溫度相比，影響更大的是液體的量，存在越少的水越有利于保存。
在微量管中的全血樣本相對穩定性較差，室溫和-20度下僅能保存3天，4度反而能保存30天，在-75度的條件下則能存儲180天。使用濾紙片的全血樣本（干血斑）需要注意密封保存，如果有條件，還可以適當添加BHT作為保護劑。如果要長期保存，還是推薦-75度條件。
簡述一下，對于所有樣本類型，最佳的條件是-80度保存。主要是多不飽和脂肪酸（PUFA）會在Fe3+和氧的作用下發生過氧化從而導致損失，因此在樣品收集過程中要盡可能減少較高溫度（如室溫）暴露時間、避免開放式放置、避免多次凍融。
當然，也會有文獻提出不同的看法，例如2016年的另一篇文章（DOI：10.1016/j.clinms.2016.12.001）提出血清、血漿樣品在室溫下24小時，在4度下至少7天，在20度下至少75天，并且3次凍融循環均穩定。考察的指標也包括PUFA，但是關于室溫下的暴露時間，明顯跟綜述有較大區別。
測脂肪酸用哪種類型的血樣？
事實上，測每種類型的都大有人在。有篇文章（DOI：10.1016/j.plefa.2007.05.003）還專門比較了血漿、紅細胞和全血中脂肪酸的主要存在形式、PUFA、n-3 Index等。發現血漿和脂蛋白中的脂肪酸譜具有一定可比性，但是與紅細胞中的完全不可比。如果要下一個結論，就是脂肪酸譜的結果僅能同類型樣本相比較。
在這篇文章的提示下，我們公司使用4位志愿者同時間點采集的血清和血漿樣本，進行了一次脂肪酸定量檢測，發現檢測到的脂肪酸種類一致，數值上血漿中的脂肪酸濃度普遍高于血清，但是這種差異并不顯著。當然，由于我們實驗的例數較少，這個結果可能不具有普遍性。
這幾年，測紅細胞中脂肪酸的文章不少，而且往往都是用大隊列研究重大疾病的相關性、早篩早診、發病機制等，這又是為什么呢？原來血清、血漿中的脂肪酸受膳食攝入影響較大，而紅細胞因為具有較長的半衰期（120天），被認為能更好地反映機體中長期（3周~3個月）脂肪酸攝入狀況，尤其是人體不能合成的必需脂肪酸如n-3脂肪酸（DOI：10.1016/j.plefa.2007.05.003）。所以在營養干預的研究中，測紅細胞的更多，要定量檢測紅細胞中脂肪酸，除了需要使用新鮮的全血樣本分離紅細胞，還需要記錄全血的體積，并檢測紅細胞壓積來用于定量計算，單位往往是ng/mL或nmol/L。有的科學研究中也直接使用紅細胞體積用于定量計算。但是，這并不意味著血清或血漿就不適合測脂肪酸，采血前務必空腹。
測總脂肪酸還是游離脂肪酸？
在生物體內大部分脂肪酸都以結合形式，如甘油三酯、磷脂、膽固醇酯等存在，少量脂肪酸以游離形式存在（DOI：10.1152/physrev.00041.2018）。這些未與甘油、膽固醇等酯化的游離脂肪酸（Free fatty acids, FFA），又可稱為非酯化脂肪酸（Nonesterified fatty acids, NEFA）。正常情況下，血樣中游離脂肪酸的含量極少，僅占總脂肪酸的5%~10%（主要包括油酸、棕櫚酸、硬脂酸等）。血樣中的脂肪酸，大部分以甘油三酯、磷脂、膽固醇酯等存在于脂蛋白中，而脂蛋白濃度極易受飲食影響。
如果要檢測total（總）的脂肪酸，是結合形式和游離形式之和。樣品制備過程使用酸水解酯鍵，再對羧基進行衍生化，GC-MS檢測。
如果要檢測free（游離）形式的脂肪酸，樣品制備過程不能使用酸或堿水解酯鍵，而是直接對羧基進行衍生化，GC-MS檢測。
關注營養攝入、脂質代謝、MUFA、PUFA、n-3 Index的建議檢測總脂肪酸，而目標明確僅關注某一種脂肪酸的變化及機制研究的建議檢測游離脂肪酸。取決于研究的具體目的和需求，并沒有完全絕對的結論。
參考文獻：
1.GB 18469-2012全血及成分血質量要求
2.WS/T 225-2024臨床化學檢驗血液標本的采集與處理
3.WS/T 225-2002臨床化學檢驗血液標本的采集與處理
4.WS/T 203-2020輸血醫學術語
5.WS/T 342-2011紅細胞比容測定參考方法
6.《全血和成分血使用標準釋義》，人民衛生出版社，中國醫學科學院輸血研究所，劉忠
7.《生理學》，中國中醫藥出版社，施建蓉、趙鐵建
8.《艾滋病性病防治》，復旦大學出版社，杜占聲
9.《艾滋病全程管理與綜合治療實踐》，人民衛生出版社，劉壽榮、戚建江
10.The stability of blood fatty acids during storage and potential mechanisms of degradation: A review
11.Fatty acid composition of plasma, blood cells and whole blood: Relevance for the assessment of the fatty acid status in humans
12.Free Fatty Acid Receptors in Health and Disease
